细菌性痢疾(菌痢)是由志贺菌属引起的具有高度传染性和严重危害的常见肠道传染病。临床表现主要为腹部痉挛痛、腹泻和发热，早期大量腹泻，水样泻往往带血和黏液，偶尔伴随其他症状如呕吐和头痛。志贺菌可分为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌4 种血清群，至少50 种血清型，菌型复杂，易变迁，其致病性和毒力也会发生相应的变化。通过几年的监测发现，余姚市志贺菌流行菌型在2009-2014年间，由福氏志贺菌1c、4c血清型为主变为以宋内志贺菌为主^[1]。本研究对2009-2014年浙江省余姚市感染性腹泻监测点腹泻患者的粪便标本进行志贺菌检测，并收集部分综合性医院检出的志贺菌，进行血清分型和毒力基因检测分析。

2009-2014年间部分综合性医院检出的志贺菌及感染性腹泻监测点检出的志贺菌。监测点粪便或肛拭标本直接分离SS平板、麦康凯平板，36℃培养24 h；同时将样品置于GN肉汤增菌，36℃培养6 h后再用上述平板分离。从平板上挑取可疑菌落接种于克氏双糖琼脂36℃培养24 h，结果为-/+，H₂S(-)的用志贺菌属诊断血清凝集。

检测到的志贺菌均经生化鉴定和血清分型。生化鉴定采用ATB Expression半自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)；ID32E由法国生物梅里埃公司提供。血清分型采用兰州生物制品研究所生产志贺菌分型试剂盒。

参考文献^[2]，选取志贺菌侵袭质粒抗原H基因(ipaH)、侵袭相关位点(ial)、肠毒素1相关基因(set1A、set1B)、肠毒素2相关基因(sen)、调控基因(virA)用普通 聚合酶链反应(PCR)进行扩增检测。引物名称、序列及产物大小为IpaH-F： 5′-TGG AAA AAC TCA GTG CCT CT-3′，R：5′-CCA GTC CGT AAA TTC ATT CT-3′，423 bp；ial-F：5′-CTG GAT GGT ATG GTG AGG-3′，R：5′-GGA GGC CAA CAA TTA TTT CC-3′，320 bp；set1A-F：5′-TCA CGC TAC CAT CAA AGA-3′，R：5′-TAT CCC CCT TTG GTG GTA-3′，309 bp；set1B-F：5′-GTG AAC CTG CTG CCG ATA TC-3′，R：5′-ATT TGT GGA TAA AAA TGA CG-3′，147 bp；sen-F：5′-ATG TGC CTG CTA TTA TTT AT-3′，R：5′-CAT AAT AAT AAG CGG TCA GC-3′，799 bp；virA-F：5′-CTG CAT TCT GGC AAT CTC TTC ACA TC-3′，R：5′-TGA TGA GCT AAC TTC GTA AGC CCT CC-3′，215 bp。

所有标本接种营养琼脂过夜，挑取菌落，置于200μl DEPC水中，100℃沸水中加热10 min，12 000 r /min 离心10 min，吸取上清作为毒力基因检测的模板。

10×PCR缓冲液2.5μl，1.5 mmol/L MgCl₂，1.5μl，200 mmol/L dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶1.5μl，引物各1.0 μl，模板2.0 μl，灭菌双蒸水15.0μl，总反应体积为25μl。反应程序：95℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，55℃退火1.5 min，72℃延伸2 min，共30 个循环，最后72℃延伸10 min，PCR产物5μl点样于1%琼脂糖凝胶中，以分子质量2000 bp的DNA Marker分子质量标志物作为参考，经gelred，110 V电泳40 min后在凝胶成像系统中观察结果并保存。

2009-2014年期间，共检出收集到志贺菌株82株，其中宋内志贺菌31 株(42.5%)，福氏志贺菌51 株(57.5%)。福氏志贺菌共分为5 种血清型，福氏1a 2株(3.9%)、福氏1c 11株(21.6%) 福氏2a 19株(37.3%)、福氏2b 4株(7.8%)，福氏4c 15株(29.4%)。不同年份血清型分布存在明显差异，2009-2014年，余姚市流行的志贺菌优势血清型为福氏志贺菌为主和宋内志贺菌次之，2013年宋内志贺菌成为主要菌型，占70.6%。2010年的优势菌型为福氏1c和4c，为该市首次检出，并且这两种血清型2010年后很少检测到，只在2013年检到4c血清型3株，见表1。

除痢疾志贺菌相关的毒力基因stx1外，我们对志贺菌致病性密切相关的6个毒力基因，侵袭质粒抗原H基因(ipaH)、侵袭相关位点(ial)、肠毒素1相关基因(set1A、set1B)、肠毒素2相关基因(sen)、调控基因(virA)进行普通PCR检测，2009-2014年共检测82株细菌，ipaH和 ial基因阳性率100%，set1A和set1B基因阳性率分别为79.3%和76.8%，且阴性菌株全部是宋内志贺菌，sen和 virA基因阳性率分别为96.3%和91.4%，阴性菌株福氏和宋内志贺菌都有，福氏志贺菌sen和 virA基因阳性率分别为96.1%和88.2%，宋内志贺菌sen和 virA基因阳性率均为96.8%，经χ²检验，差异无统计学意义(χ²=0.03，P=0.87； χ²=1.80，P=0.18)。检测结果说明肠毒素1相关基因(setlA、setlB)在宋内志贺菌存在缺失的现象，见表2。

志贺菌引起的菌痢是一种常见多发性肠道传染病，特别是在发展中国家，仍位于传染病发病数的前列。本地区菌痢的病原菌以福氏志贺菌、宋内志贺菌为主，发病率逐年下降，且呈散发状态^[3]。2009-2014年，余姚市流行的志贺菌优势血清型为福氏志贺菌为主和宋内志贺菌次之，各年流行菌型呈多样性，2009年以F2b、F4c为主，2010年F1c、F4c均有检出，2011、2012年F2a成为优势菌型，宋内志贺菌也有检出，2013年宋内志贺菌成为主要流行菌型，到2014年，F2a又成为主要菌型。志贺菌不同时期流行菌型的变化可能是每年菌痢发病率高的重要原因之一，并且菌型的改变在流行病学上具有重要意义，本研究通过几年的监测总结，对余姚市菌痢的预防、治疗以及诊断发挥了重要作用。

2010年余姚市检出的福氏1c和4c，为本地区首次检出，并且这两种血清型2010年后很少检测到，只在2013年检到3株F4c血清型。检出的福氏1c和4c血清型，可能为福氏1d和福氏Xv亚型，鉴于诊断血清的限制，本研究仍暂定为福氏1c和4c血清型^[1]。检出菌株2010年以1c和4c为主，2013年以宋内志贺菌为主，且菌株数量明显多于其余年份，除了和菌痢的发病率相关外，可能与关注度有关，有待在以后的工作中改进。

志贺菌致病的分子机制非常复杂，一般认为与不同基因编码的几种毒力因子密切相关。本次实验选择6种与毒力相关的基因进行检测。ipaH基因与志贺菌侵袭力相关，位于质粒及染色体上，稳定性较好，可用于志贺菌的分子鉴定。ial基因与细菌与肠细胞黏附相关，位于质粒中，有丢失的可能，本次实验结果显示，82株志贺菌ipaH、ial基因阳性率均为100%，高于相关报道^[4]。

志贺菌肠毒素1由set1A、set1B基因编码，能引起志贺菌病水样泻，主要存在于福氏志贺菌中，在其他志贺菌血清型中相对存在较少^[5]。志贺菌肠毒素2由 sen基因编码，位于质粒中，与志贺菌侵袭力相关。结果显示，福氏志贺菌set1和sen基因阳性率分别为100%和96.1%，宋内志贺菌set1和sen基因阳性率分别为42.0%和96.8%，区别于相关报道。virA基因是一个广泛的调控基因，对许多基因均有调控作用，是志贺菌毒力基因的重要调节子^[2]，福氏、宋内志贺菌阳性率分别为88.2%和96.8%，两者无明显差别。

志贺菌毒力相关的基因很多，本次实验共检测了6个毒力基因。细菌毒力基因携带状况较复杂，福氏、宋内志贺菌毒力基因阳性率有较大的区别，鉴于本次样品数量相对较少及每年分布不均，所得结果可能不能完全反映本地区志贺菌菌型及毒力基因的基本情况，有待于进一步监测和研究。