2015, Vol. 30扩展功能
文章信息
- 舒高林, 牛桓彩, 刘国蓉, 崔晶花, 崔志刚, 杜小莉, 芦丹, 马文军, 赵维勇
- SHU Gao-lin, NIU Huan-cai, LIU Guo-rong, CUI Jing-hua, CUI Zhi-gang, DU Xiao-li, LU Dan, MA Wen-jun, ZHAO Wei-yong
- 北京市昌平区食源性金黄色葡萄球菌药敏分析及分子流行病学特征研究
- Drug susceptibility and molecular epidemiology of Staphylococcus aureus isolated in Changping district of Beijing
- 疾病监测, 2015, 30(9): 770-775
- Disease Surveillance, 2015, 30(9): 770-775
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2015.09.017
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文章历史
- 收稿日期：2015-04-02
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, PulseNet China室, 北京 102206
2. State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是革兰阳性耐盐生长的致病菌,仅次于沙门菌和副溶血性弧菌的第三大食源性致病菌。近几年我国发生的细菌性食物中毒病例中,20%～25%是由金黄色葡萄球菌引起的[1]。2010-2012年北京市共报告细菌性食物中毒27起,其中金黄色葡萄球菌食物中毒占22%[2]。2011-2014年昌平区食品安全风险监测结果显示,该区食品中金黄色葡萄球菌检出率分别为12.61%(14/111)、15.29%(26/170)、7.69%(11/143)和9.38%(21/224),金黄色葡萄球菌是昌平区污染食品的主要致病菌(数据为该区统计数据),为提高食源性疾病监测预警能力,了解昌平区食源性金黄色葡萄球菌的分子流行病学特征及耐药谱分布,本研究对2011-2014年昌平区食品安全风险监测项目和7次食物中毒疫情处理中,从各种食品及2件涂抹样品分离得到的74株金黄色葡萄球菌进行了药物敏感性试验,脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型试验,以及对肠毒素、杀白细胞毒素和耐热磷酸酶毒力因子编码基因检测试验。
1 材料与方法 1.1 实验菌株来源74株金黄色葡萄球菌分别为食品安全风险监测项目中从各类生、熟食品样品分离出的57株、突发公共卫生事件食物中毒调查处理采集的可疑食物样品中分离出的15株以及涂抹样品分离2株,所有菌株均经VITEK2进行生化鉴定,且血浆凝固酶阳性。
1.2 仪器和试剂 1.2.1 仪器本研究涉及的主要仪器有恒温培养箱(日本三洋),McFarland标准比浊仪(法国生物梅里埃公司),水浴摇床(德国优莱伯),聚合酶链反应(PCR)仪(德国Sensoquest),VITEK2生化仪(法国生物梅里埃),PFGE及配套设备和凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2.2 试剂7.5%氯化钠肉汤、普通营养琼脂购自青岛海博生物技术有限公司；LB琼脂购自北京陆桥生物技术有限公司；CHROMagar金黄色葡萄球菌显色琼脂平板购自郑州博赛生物技术有限公司；血琼脂平板、革兰阳性细菌鉴定卡、革兰阳性细菌药敏卡(AST-GP67)和β－内酰胺酶快速检测试剂盒均购自生物梅里埃中国有限公司；溶葡萄球菌酶购自美国Sigma公司；SeaKem Gold购自美国Lonza公司；SmaⅠ 内切酶、XbaⅠ 内切酶、rTaq酶、ExTaq酶购自大连宝生物工程有限公司。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923购自中国药品生物制品检定所,所有培养基和试剂均在有效期内使用。
1.3 方法 1.3.1 菌株的分离鉴定依据GB 4789.10-2010分离鉴定金黄色葡萄球菌[3]。
1.3.2 药物敏感性试验用全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK2 Compact进行药敏实验,AST-GP67药敏鉴定卡抗菌药物信息和最低抑菌浓度(MIC)结果判读依据见表1[4],β－内酰胺酶测定应用纸片法,将浸有产色素的头孢菌素纸片用高压灭菌后的纯水浸湿,刮取新鲜菌株培养物在头孢菌素纸片上研磨均匀,红色出现者判读为β－内酰胺酶阳性,1 h后无颜色改变者判读为β－内酰胺酶阴性。
| 抗菌药物 | 英文 缩写 | MIC检测范围 (μg/ml) | MIC解释标准(μg/ml) | ||
| 敏感 | 中介 | 耐药 | |||
| 青霉素 | PEN | 0.030~0.500 | ≤0.12 | - | ≥0.25 |
| 苯唑西林 | OXI | 0.250~4.000 | ≤2.00 | - | ≥4.00 |
| 庆大霉素 | GM | 0.500~16.000 | ≤4.00 | 8 | ≥16.00 |
| 环丙沙星 | CIP | 0.500~8.000 | ≤1.00 | 2 | ≥4.00 |
| 左氧氟沙星 | LEV | 0.125~8.000 | ≤1.00 | 2 | ≥4.00 |
| 莫西沙星 | MXF | 0.250~8.000 | ≤0.50 | 1 | ≥2.00 |
| 红霉素 | ERY | 0.250~8.000 | ≤0.50 | 1~4 | ≥8.00 |
| 克林霉素 | CM | 0.250~8.000 | ≤0.50 | 1~2 | ≥4.00 |
| 喹努普汀/达福普汀 | QDA | 0.250~16.000 | ≤1.00 | 2 | ≥4.00 |
| 利奈唑胺 | LNZ | 0.500~8.000 | ≤4.00 | - | ≥8.00 |
| 万古霉素 | VA | 0.500~32.000 | ≤2.00 | 4~8 | ≥16.00 |
| 四环素 | TE | 1.000~16.000 | ≤4.00 | 8 | ≥16.00 |
| 替加环素 | TGC | 0.120~2.000 | ≤0.12 | - | ≥2.00 |
| 呋喃妥因 | FT | 16.000~512.000 | ≤32.00 | 64 | ≥128.00 |
| 利福平 | RA | 0.500~32.000 | ≤1.00 | 2 | ≥4.00 |
| 复方新诺明 | SXT | 0.500/9.500～16.000/304.000 | ≤2.00/38.00 | - | ≥4.00/76.00 |
| 注：(1)“-”表示无数据；(2)“/”左边的数字为复方新诺明浓度，“/”右边的数字为叶酸代谢途径抑制剂浓度。 | |||||
用PCR方法对金黄色葡萄球菌肠毒素sea、seb、sec、sed、seg、seh、sej、sel、sem、sen、seu、see 和sek编码因子基因,杀白细胞毒素lukF、lukS编码因子基因,耐热磷酸酶nucA编码因子基因进行检测。取LB平板培养基上的金黄色葡萄球菌单克隆菌落于1.5 ml离心管中,加入1×TE 500 μl缓冲液中研磨至菌液混浊一致,放入100 ℃水浴煮10 min,10 000 r/min离心15 min,取上清液作为毒力因子编码基因PCR检测模板。PCR反应体系为20 μl,包含模板DNA 2 μl,上下游引物各(10 μmol/L) 1 μl,rTaq酶10 μl,水6 μl。毒力因子编码基因引物根据Lyu等[5]报道文献的序列为参考,由上海生工生物工程有限公司合成,具体序列参见文献[5］。PCR反应程序为 94 ℃预热5 min,94 ℃ 40 s,50 ℃ 40 s,72 ℃延伸30 s,30个循环,72 ℃延伸10 min,PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中成像。外膜蛋白编码基因spa作为内标阳性对照。
1.3.4 PFGE 1.3.4.1依据报道的金黄色葡萄球菌PFGE操作方案[6],将菌株接种于血琼脂平板上,37 ℃培养 24 h,挑取单菌落接种于LB琼脂培养基上,37 ℃培养18 h,用CSB悬菌,并将菌液浓度调至4.2~4.5麦氏单位,向250 μl菌悬液中加入4 μl溶葡萄球菌酶,56 ℃水浴30 min,用1%SeaKem Gold制备胶块。SmaⅠ内切酶(40 U)30 ℃酶切3 h。电压6 V/cm,脉冲时间4~40 s,电泳18 h,电泳温度14 ℃。电泳后将胶块放入GelRed染色30 min后用Bio-Rad Gel XR成像仪读取结果。
1.3.4.2 数据分析用BioNumerics software软件对实验菌株DNA酶切电泳图谱进行数据分析,得出聚类分析图。聚类图根据非加权配对算术平均法构建,选用Dice系数估算菌株彼此之间的相似性。
2 结果 2.1 药物敏感性试验所有菌株对6种抗生素MXF、QDA、LNZ、VA、TGC、FT均敏感。除6株菌对所有药物敏感外,其余68株有不同程度的耐药(91.89%),其中对PEN耐药率最高(87.84%),其次为ERY(44.59%)和CM(39.19%),见表2。3种及以上抗生素耐药菌株有30株,多重耐药率为40.54%(30/74)。68株菌表现出15种耐药谱,其中28株仅表现对PEN单一耐药,占41.18%(28/68)；双重耐药10株,占14.71%(10/68),为PEN-TE、PEN-ERY和ERY-CM耐药谱；30株表现为多重耐药,占44.12%(30/68),以PEN-ERY-CM耐药谱为主。其中2011年15株耐药菌只表现2种耐药谱,耐PEN占53.33%(8/15),三重耐药PEN-ERY-CM占46.67%(7/15)；2012年23株耐药菌,双重耐药占17.39%(4/23),多重耐药菌占39.13%(9/23)；2013年11株耐药菌双重耐药占18.18%(2/11),多重耐药占36.36%(4/11)；2014年17株耐药菌,双重耐药占16.67%(3/18),多重耐药占38.89%(7/18),见表3。74株金黄色葡萄球菌中64株产β－内酰胺酶 (86.49%)。另外,从肉类食品中分离的菌株耐药情况较其他食品的菌株严重且复杂,如琵琶腿、猪排骨、猪肉大葱灌汤水饺(生制)对CIP、ERY、CM、TE、SXT 5种抗生素耐药,鸡胸和羊肉串对GM、CIP、ERY、CM、TE、SXT 6种常用抗生素耐药,其中猪排骨对苯唑西林耐药,见图1。
| 抗生素 名称 | 耐药 | 中介 | 敏感 | |||
| 菌株数 (株) | 耐药率 (%) | 菌株数 (株) | 中介率 (%) | 菌株数 (株) | 敏感率 (%) | |
| PEN | 65 | 87.84 | 0 | 0.00 | 9 | 12.00 |
| OXI | 1 | 1.35 | 0 | 0.00 | 73 | 98.65 |
| GM | 5 | 6.76 | 3 | 4.05 | 66 | 89.19 |
| CIP | 3 | 4.05 | 4 | 5.41 | 67 | 90.54 |
| LEV | 0 | 0.00 | 3 | 4.05 | 71 | 95.95 |
| ERY | 33 | 44.59 | 1 | 1.35 | 40 | 54.05 |
| CM | 29 | 39.19 | 1 | 1.35 | 44 | 59.46 |
| TE | 13 | 17.57 | 0 | 0.00 | 61 | 82.43 |
| 抗生素名称 | 抗生素种类 | 各年度耐药菌株 | ||||
| 2011年 | 2012年 | 2013年 | 2014年 | 合计 | ||
| PEN | 1 | 7 | 8 | 5 | 8 | 28 |
| PEN-ERY-CM | 3 | 8 | 5 | 3 | 4 | 20 |
| PEN-TE | 2 | 0 | 2 | 2 | 3 | 7 |
| PEN-ERY | 2 | 0 | 2 | 0 | 0 | 2 |
| ERY-CM | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| PEN-GM-ERY | 3 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| PEN-ERY-CM-TE | 4 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| PEN-ERY-CM-SXT | 4 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| GM-ERY-RA-SXT | 4 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| CIP-ERY-CM-TE | 4 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| PEN-GM-ERY-CM-SXT | 5 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| PEN-CIP-ERY-CM-TE | 5 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| PEN-OXI-ERY-CM-TE | 5 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| PEN-GM-ERY-CM-TE-SXT | 6 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| PEN-GM-CIP-ERY-CM-TE | 6 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
|
| 图1 74株金黄色葡萄球菌PFGE聚类图 Fig.1 ;PFGE patterns of 74 S. aureus strains |
74株食源性金黄色葡萄球菌肠毒素毒力因子检测率情况如下：sea 25.68%(19/74),seb 13.51%(10/74),sec 10.81%(8/74),sed 1.35%(1/74),seg 14.86%(11/74),seh 9.46%(7/74),sej 14.86%(11/74),sel 10.81%(8/74),sem 14.86%(11/74),sen 33.78%(25/74),seu 14.86%(11/74)。肠毒素基因检出阳性率为64.86%(48/74),其中携带1种肠毒素基因的有13株,占27.08%(13/48),携带2种以上肠毒素基因的有35株,占72.92%(35/48)。肠毒素基因种类主要以sen为主,其次为sea,其余肠毒素基因检出率均在9.46%～14.86%之间,未检出含see、sek、seq肠毒素基因的菌株。74株金黄色葡萄球菌66株耐热磷酸酶(nucA)阳性,阳性率为89.19%。57株菌的杀白细胞毒素编码基因lukF检出为阳性(77.03%),2株lukS为阳性(2.70%)。食物中毒事件中分离的菌株(20110791SP-1,20110791SP-2,SP2013003101,SP2013003102)肠毒素检出为阴性,但杀白细胞毒素和耐热磷酸酶阳性。
2.3 PFGE 结果74株菌分子型别呈多态性,除9株菌不可分型外,其余65株菌分为40个不同的PFGE型别,分别命名为PFGE01-PFGE40,见图1,其中PFGE10,PFGE11,PFGE20型别菌株数量相对较多,分离于不同年份,可能为昌平区近4年的流行克隆株。各年份菌株PFGE型别无明显聚集分布,成簇菌株分布无年代特征。流行病学相关性菌株多数为同一型别,例如7起食物中毒事件中分离出的菌株,除个别菌株(SP2012020902,SP2012020907,SP2013003105)外,在同一次事件中分离的菌株都具有相同型别。
2.4 PFGE分型与毒力因子及药物敏感性的关系多数具有相同PFGE型别的菌株其毒力基因携带情况和耐药谱是相同的。特别是7起食物中毒事件中分离的菌株,具有相同PFGE型别的菌株携带相同的肠毒素基因。PFGE带型一致而毒力基因携带情况完全一致的菌株为72.97%(27/37)。PFGE带型一致而药敏结果完全一致的菌株为64.86%(24/37)。
3 讨论金黄色葡萄球菌是引起食源性疾病的常见菌,2011-2014年昌平区每年均有食源性疾病报告,4年间由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病占昌平区所有报告的食源性疾病的第1位。另外,耐药金黄色葡萄球菌是近年医院内感染和社区感染的主要病原菌,并具有多重耐药的特点,近年食源性金黄色葡萄球菌也表现出多重耐药的现象。本研究结果显示昌平区分离的74株食源性金黄色葡萄球菌青霉素耐药率最高87.84%,与2013年刘伟等[7]报道青霉素耐药率为89.0%的结果相近。青霉素耐药菌株中除1株菌外,其他均为β－内酰胺酶检测阳性,这是金黄色葡萄球菌能产生水解β－内酰胺环的酶而产生的耐药性,属于比较多见的情况。其次,红霉素(44.59%)和克林霉素(39.19%)耐药率也较高,与以往报道结果相似。如王迪等[2]报道北京市食源性MRSA红霉素耐药率45.45%,克林霉素耐药率20.86%；张扬等[8]报道北京市通州区红霉素耐药率37%、克林霉素耐药率19%。另外,本研究发现食源性金黄色葡萄球菌的多重耐药情况也很严重,对3种及以上抗生素耐药的菌株耐药率40.54%。68株耐药菌株表现出15种耐药谱,主要耐药谱为PEN+ERY+CM。还有,从肉类食品中分离的菌株耐药情况较其他食品的菌株严重且复杂,可能与畜牧业养殖过程中滥用抗生素有关。因此加强金黄色葡萄球菌耐药性监测,对合理选用抗菌性药物具有重要意义。
74株金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR检测结果分析,肠毒素基因阳性率64.86%(48/74),低于刘伟等[7]报道的北京市海淀区金黄色葡萄球菌产肠毒素阳性率(85.0%),与张严峻等[9]对食品中分离的51株金黄色葡萄球菌检测发现肠毒素基因携带率(68.70%)相近。另外,研究结果显示产2种以上 肠毒素的菌株较多,占72.92%(35/48),主要以sen和sea肠毒素编码基因为主。与刘伟等[7]报道北京市海淀区,张扬等[8]报道北京市通州区金黄色葡萄球菌肠毒素均以see编码基因为主相近。与沈伟伟等[10]报道浙江省台州市金黄色葡萄球菌以sea、seq编码基因为主不同。肠毒素是金黄色葡萄球菌致病的主要毒力因子,因此较高的检出率和2种以上肠毒素携带情况标志着这些菌株具有较高的潜在食品安全风险。耐热磷酸酶和杀白细胞素也与金黄色葡萄球菌的致病力有紧密相关性,虽然有些菌株肠毒素检出为阴性,但这两个毒力因子的编码基因检测为阳性,所以也不能确定这些菌株为非致病性的。
PFGE分子分型结果显示昌平区食源性金黄色葡萄球菌基因型呈多态性。但由于不可分型的菌株存在,用PFGE方法分型可能存在一定的弊端,今后在分子分型方面的研究需考虑采用其他的方法进行。有3个PFGE型别(PFGE10,PFGE11,PFGE20)的菌株分别分离于昌平区不同年份的食品样品中,说明这些克隆株可能在该地区流行,但需要扩大菌株数目来进一步证明。回顾性分析7起食物中毒事件中分离菌株的分子型别,发现其中5起食物中毒事件的分离菌株PFGE带型完全一致,2起事件中有PFGE带型不同的分离菌株,但由于缺少患者的分离菌株做比较,难以阐明PFGE在暴发溯源方面的作用。PFGE带型一致的菌株携带毒力因子的情况不完全相同,因此金黄色葡萄球菌PFGE型别无法区分致病性强弱的菌株。耐药金黄色葡萄球菌的PFGE带型与耐药谱之间也无明确关联性,与王迪等[2]报道一致。
昌平区2011-2014年分离的食源性金黄色葡萄球菌具有较强的耐药性,分子多态性,和毒力因子携带率较高的特征,说明这些菌株可以导致潜在的食品安全问题,需要疾病预防部门积极应对,制定相应的措施,做好金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的预防和控制工作。
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