感染性腹泻是导致婴幼儿死亡的主要原因之一，一直是全球性的公共卫生问题，至今仍未得到有效控制，尤其在发展中国家。目前引起腹泻的微生物主要有细菌和病毒，以轮状病毒、诺如病毒、致泻性大肠埃希菌(Diarrheagenice E.Coli. DEC)、沙门菌、志贺菌等最常见^{[1, 2]}。为掌握浙江省5岁以下患儿感染性腹泻的流行病学特征和主要病原构成，从2012年开始按照浙江省肠道综合监测方案要求，选择1家省级儿童医院作为腹泻监测点，按月采集＜5岁腹泻患儿粪便，每年150份左右，进行相关病毒和细菌检测，通过3年病原学特征分析，以期能为制定针对性的预防和控制措施提供科学依据。

以浙江大学医学院附属儿童医院作为监测哨点医院，收集2012年1月至2014年12月来自浙江北部(杭州、嘉兴、湖州地区)及浙江中部(绍兴、金华地区)的5岁以下腹泻患儿的临床资料和粪便标本426例开展研究。

选择符合WS 271-2007《感染性腹泻诊断标准》发病10天以内或入院24 h内的临床病例，流行病学资料经家长知情同意后，调查人员采用现场问卷调查方式获得，内容包括性别、年龄、发病日期、临床表现(如腹泻天数/次数、发热、呕吐等)及流行病学特征等。完成问卷后护士用采便器采取合格便样，迅速置于无菌PV采样管(供病毒检验)和Carry-Blair运送培养基(供细菌检验)内。然后置4～8 ℃生物安全运送箱中保存不超过2 h，送达实验室立刻进行细菌检测，病毒项目标本置-80 ℃冻存，集中检测。

细菌项目有肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)、肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、沙门菌、志贺菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、EHEC O157∶H7、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌共14种。病毒项目有诺如病毒(NV)、轮状病毒(RV)、腺病毒(ADV)、札如病毒( SAV)、星状病毒(ASV)共5种。

ATB细菌鉴定和药敏测试仪(法国梅里埃)、QIAcube全自动核酸提取系统(德国凯杰)、7500 荧光定量PCR仪(美国ABI)等。细菌分离鉴定用增菌液、培养基、诊断血清，病毒和细菌核酸提取及检测试剂盒批号不等，使用前均通过质量鉴定合格，且在有效期内使用。

DEC、志贺菌、空肠弯曲菌采用直接分离培养。EHEC O157∶H7、沙门菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌经选择性增菌后，接种相应的培养基，在适宜的培养温度下培养18～24 h，挑取可疑菌落进行初步生化鉴定，再进一步用API或ID32E、ID32GN 生化条鉴定确认，沙门菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌还需进行血清学证实，5种DEC核酸分型确认后，再进行血清分型。

DEC核酸提取：每一样本分别挑取5个经生化鉴定符合大肠埃希菌落各1大环，分别至1 ml的0.85%灭菌生理盐水，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，再加入100 μl灭菌去离子水混匀，100 ℃金属浴煮沸12 min，12 000 r/min 离心15 min，吸取200 μl 上清液，采用QIAcube提取仪和提取试剂提取EPEC/EHEC/ETEC/EIEC/EAEC目的基因。病毒核酸提取：每一样本取约2 g粪便，加生理盐水制成20%的菌悬液，8000 r /min 离心5 min，吸取200 μl上清液，采用QIAcube提取仪和提取试剂提取各病毒核酸。

采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，real time RT-PCR)检测 RV、NV、ASV 和SAV。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，real time PCR)检测ADV和DECStx1、Stx2、Eae、Aggr、ipaH、LT、ST共7种目的基因。核酸检测试剂盒均由上海辉睿生物科技有限公司生产，试剂配制及荧光定量PCR反应条件参见试剂盒说明书。

调查问卷设计完成后，经预调查修改完善后正式使用。调查人员由经专题培训的疾病预防控制中心流行病医师担任。调查实行签名制，当日调查工作结束后审核员复核问卷，及时发现问题，剔除不合格问卷。

以EpiData 3.1软件建立数据库，采用盲法双录入，逻辑纠错，以保证数据资料的可靠性。采用SPSS 13.0 软件进行统计分析。计数资料采用χ²检验，检验水准α=0.05，P < 0.05 为差异有统计学意义。

本次监测共收集426例标本，均为 < 5岁的腹泻患儿，散居儿童占99.83%，年龄最小的6 d，最大54月龄，2岁以下病例有396例，占全部病例的92.96%， 11月龄病例占74.88%，所分5个月龄组病例性别构成差异无统计学意义(χ²=4.904，P=0.297)。

426份标本共检出病原248株，检出率为58.22%。其中检出病毒187株，阳性检出率为43.90%。检出细菌61株，阳性检出率为14.32%。248株病原分离自208例腹泻患儿，其中单病原感染172例(128例单一病毒感染、44例单一细菌感染)、多病原混合感染36例(双重病毒感染18例、三重病毒感染1例、病毒和细菌合并感染17例)。

426份标本经荧光定量PCR检测，检出病毒187株，以RV的检出率最高82株，占(43.85%)，其余由高到低依此为NV 78株(41.71%)、ADV 14株(7.49%)、SAV 12株(6.42%)、ASV 1株(0.53%)。82株RV经分型均为A组，78株NV中GⅡ型77株(98.72%)，GⅠ型1株占1.28%。

426份标本经病原分离鉴定及DEC毒力基因检测，检出病原菌61株，DEC检出率最高共38株(62.30%)，其余由高到低依次为沙门菌17株(27.87%)、小肠结肠炎耶尔森菌3株(4.92%)、嗜水气单胞菌2株(3.28%)、空肠弯曲菌1株(1.64%)。38株DEC PCR检测结果，EAEC 20株(52.63%)，EPEC 14株(36.84%)，ETEC 4株(10.53%)，EHEC和EIEC未检出，经血清学凝集试验可分型16株，未分型22株。17株沙门菌经血清分群，依次为B群8株(47.06%)，C1群5株(29.41%)，D群2株(11.76%)，E1群1株(5.88%)，E4群1株(5.88%)。3株小肠结肠炎耶尔森菌经血清分群均为O3群。

426 例监测病例中，男性272例，女性154例，男女性别比为1.77∶1，病毒男性检出率44.12%，女性检出率43.15%。不同性别病毒检出率差异无统计学意义(χ²=0.015，P=0.903)。细菌男性检出率13.60%，女性检出率15.58%。不同性别细菌检出率差异无统计学意义(χ²=0.315，P=0.575)。

分析患儿各月龄组病毒检出率差异有统计学意义(χ²=64.917，P=0.000)，进一步比较每种病毒各月龄组检出情况，NV检出率不同月龄组差异有统计学意义(χ²=40.546，P=0.000)，其中6～23月龄组检出率最高，占NV总检出数的80.77%(63/78)， 6月龄组检出率最低，占总检出数的5.56%(9/78)，6～23月龄组与其余月龄组NV检出率比较差异有统计学意义(χ²=25.751，P=0.000)。ADV检出率不同月龄组差异有统计学意义(χ²=9.546，P=0.049)，以24～35月龄检出率最高，与其余月龄组比较差异有统计学意义(χ²=4.005，P=0.045)。RV在不同月龄组检出率各不相同，但差异无统计学意义(χ²=3.234，P=0.520)。SAV仅在6～23月龄组有12例、ASV仅36～54月龄组检出1例，见表1。

5种病原菌不同月龄组检出情况各不相同，沙门菌各组都有检出，DEC、小肠结肠炎耶尔森、嗜水气单胞菌、空肠弯曲菌各月龄组检出情况略有不同。分析各月龄组间病原菌检出率，差异无统计学意义(χ²=8.867，P=0.065)，表明各月龄组病原菌检出率均衡，见表2。

病毒3年检出率依此为38.46%、57.62%、33.61%，比较3年检出率，差异有统计学意义(χ²=18.521，P=0.000)。进一步比较每种病毒3年检出率，其中RV各年度检出率差异有统计学意义(χ²=8.851，P=0.012)，以2013年检出率最高。NV各年度检出率差异无统计学意义(χ²=0.529，P=0.768)，各年度检出率均衡，见表3。细菌3年检出率依次为14.74%、15.89%、11.76%，比较年度间检出率差异无统计学意义(χ²=0.961，P=0.618)，细菌各年度检出率均衡，见表4。

根据不同季节分析，患儿四季病毒检出率依此为春季(35月)42.34%、夏季(68月)30.77%、秋季(911月)41.51%、冬季(122月)78.79%，四季检出率差异有统计学意义(χ²=42.18，P=0.000)，以冬季为最高，与其他三季检出率比较差异有统计学意义 (χ²=38.61，P < 0.01)。进一步比较各病毒四季检出情况，RV冬季检出率最高，占其总检出率39.02%，分别与春、夏、秋三季检出率比较，差异有统计学意义(χ²=16.03，35.50，29.51，P < 0.01)。NV秋季检出率最高，占其总检出率37.18%，与春、夏二季检出率比较，差异有统计学意义(χ²=6.43，5.36，P < 0.05)。ADV春夏秋三季均有病例检出，SAV仅在冬春季有少量病例检出、ASV仅在春季检出1株，见表5。

腹泻患儿四季细菌检出率依次为春季11.71%，夏季19.58%，秋季16.04%，冬季4.55%，细菌四季检出率比较差异有统计学意义(χ²=9.235，P=0.026)，以夏季最高。进一步比较5种病原菌四季检出情况，DEC夏秋季检出率最高，占其总检出率78.95%，与冬春季比较差异有统计学意义(χ²=7.217，P=0.007)。沙门菌感染在四季均有发生，经检验χ²=1.550，P=0.671，差异无统计学意义。小肠结肠炎耶尔森菌仅在春夏二季检出3株，嗜水气单胞菌仅在春秋二季检出2株、空肠弯曲菌仅在春季检出1株，见表6。

腹泻是当今全球性的重要公共卫生问题之一，已引起国内外学者的高度重视。多年来学者们对婴幼儿腹泻进行过大量的研究，多侧重细菌或者病毒的监测和分析，同时进行细菌和病毒病原谱及流行病学分析研究的报道较少。本研究选择浙江大学医学院附属儿童医院作为监测点，患儿来自浙江中北部各地区，能较全面地反映该地区婴幼儿腹泻感染状况。426例 < 5岁患儿14种肠道致病菌和5种腹泻病毒的检测结果显示，病原阳性检出率为58.22%，其中病毒阳性检出率(43.90%)，细菌阳性检出率(14.32%)，居前4位的腹泻病原依此是RV(19.25%)、NV(18.31%)、DEC(8.92%)、沙门菌(3.99%)。病毒性病原占重要地位，其中RV和NV感染占病毒总检出数的85.56%，5岁以下婴幼儿是NV和RV感染的高发人群，此结论与洪万胜等^[3]报道一致。

患儿年龄和性别分析显示，426例患儿中男性272例，女性154例，男女性别比为1.77∶1。男女患儿细菌和病毒检出率比较，病原感染无性别差异。分析各年龄组病毒和细菌检出率，各年龄组细菌感染没有明显差异，而病毒感染则以6～23月龄检出率最高，24～54月龄检出率次之、 < 6月龄最低，与国内外多数报道基本一致^[4]。

患儿季节分布特征分析，患儿病毒感染存在明显季节性特征，以冬季最高。其中RV和NV感染季节性分布特征明显，RV在冬季呈现高峰，NV感染在秋季呈现小高峰，与国内外的报道基本一致^[5]，符合温带国家“秋冬季病毒高发，夏季最低”的流行特征^[6]。有研究显示，RV的感染与天气寒冷、干燥和降水量有关^[7],也与秋冬季气温较低，湿度加大,病毒存活时间长，利于病毒传播有关。患儿病原菌感染也存在季节性特征，夏秋季高于春冬季以夏季最高，与文献报道^{[8, 9]}的由细菌引起的腹泻夏季是发病高峰的结论完全一致。可能与夏季的饮食习惯，自然界水源污染机会增多，适宜病原菌生长繁殖有关；也可能与高温条件下，肠道病原菌携带的大量毒性质粒被激活，对人体的侵袭力和扩散力增强有关^[10]。

随着腹泻病研究的不断进展，多病原混合感染越来越受到学者的重视。此次研究共检测到多病原混合感染36例，混合感染率达17.31%，略低于叶新华等^[11]报道的兰州地区的阳性率(13.5%)。混合感染＜2岁的患儿占88.89%,且以RV与NV、NV与DEC混合为主。与任增志等^[12]报道一致。近年来混合感染的现象多有报道^{[13, 14]},组合种类多样，且2岁内高发，这与婴幼儿免疫系统尚不成熟，抵抗力弱有关。多病原混合感染是否增强疾病程度尚未知,有待进一步研究。

DEC引起的腹泻已引起学者的广泛重视，资料显示居检出率前3位的大多为EPEC、ETEC、EIEC。此次研究，DEC检出率为8.92%,居病原菌之首,成为5岁以下婴幼儿细菌性腹泻的最主要病原。此结果与北京地区及河南省儿童腹泻主要病原菌分布相一致^{[15, 16]}，与深圳市东部地区以EPEC占比例最高^[17]有所不同。虽然全国的DEC的检出率各不相同，但大都处于腹泻病原菌的前3位^[18]。DEC检出率除了地域的因素外，与检测方法有很大关系。传统的检测以分离培养，血清鉴定为准，检出率相对较低，本研究采用分离培养与核酸检测相结合的方法，大大提高了检出率。对38株DEC血清分型发现，只有10株DEC血清可分型，余22株均未能分型，此结果与文献报道的一致^[19]。这种现象可能与免疫动物时对实验室、免疫剂量、动物系别等要求较高，免疫血清质量难以控制有关；也可能与细菌的变异，导致致病力的缺失或获得有关。有学者提出细菌是否携带毒力基因和有无致病能力，不能单凭血清分型来判断。Fujioka等^[20]认为,临床分离的DEC血清型别与毒力基因并无相关性。对于DEC血清型别与毒力基因间的关系有待进一步深入研究。

本次研究积累了浙江中北地区近3年5岁以下婴幼儿感染性腹泻病原分布和流行病学资料，为该地区婴幼儿腹泻的流行特征与优势病原体提供了基础数据，也为制定有效的预防控制措施提供了理论依据。