福氏志贺菌是发展中国家细菌性痢疾的重要病原菌，全球每年有1.25亿例痢疾病例，其中由福氏志贺菌引起的占80%以上^[1]。根据O抗结构的差异，福氏志贺菌最初分为13种血清型(1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6、X和Y)。近几年来，一新的O抗修饰方式及其介导的血清型陆续被揭示和发现，进一步将1a、2a、3a、4a、5a、X和Y分为不同的亚型，目前的血清型达30余种^[2]。除血清6型外，所有血清型的O抗具有相同的四糖骨架，在骨架的不同糖基上进行乙酰化、糖基化和磷酸乙醇胺化修饰，产生了不同的抗原表位，形成了不同的血清型^{[3, 4, 5, 6, 7]}。Y血清型具有基本的O抗四糖骨架，没有任何修饰。乙酰化修饰和磷酸乙醇胺化修饰是由单个基因oac(oacA、oacB、oacC、oacD)和opt (optII和optIII)介导完成的，他们分别位于基因组和质粒上^{[4, 5, 7, 8, 9]}；而糖基化修饰是由血清型转换噬菌体携带的、由3个基因形成的gtr基因簇(gtrA、gtrB、gtr_type)介导完成的，前两个基因高度保守，而第三个基因gtr_type编码糖基转移酶，是血清型特异的^[10]。

通过噬菌体、质粒等可移动元件携带的血清型O抗修饰基因在不同血清型菌株间的转移，介导血清型转换，这是福氏志贺菌血清型产生机制。gtrI基因簇(gtrA、gtrB、gtrI)是由血清型转换噬菌体SfI携带，通过感染Y、3b和X血清型菌株，介导在四糖骨架的N-乙酰葡糖胺基团添加糖基，呈现抗原表位I，血清型分别转换为1a、1b 和1d ^[11]。其中1a血清型O抗四糖骨架仅在N-乙酰葡糖胺基团发生糖基化修饰，而1b和1d血清型O抗四糖骨架除N-乙酰葡糖胺基团上的糖基化修饰外，还分别由噬菌体Sf6和SfX介导在第一个鼠李糖和第三个鼠李糖上发生乙酰化和糖基化修饰，导致群抗原表位6、7、8的出现^[8]。

人体对志贺菌的免疫是血清型特异的，即人体只对同样血清型的再次感染具有免疫保护作用。因此，O抗修饰基因的功能性失活突变，同噬菌体、质粒结构介导的O抗修饰和血清型转换一样，是菌体与人类斗争过程中获得适用性进化。为进一步丰富对福氏志贺菌血清型转换及其机制的认识，本研究通过对监测收集的福氏志贺菌菌株，进行血清型多重聚合酶链反应(PCR)分型研究。

5株血清型Y福氏志贺菌株从19972010年间全国细菌性痢疾监测收集菌株中筛选出(表 1)。菌株2001019(1a)和2003036(Y)作为对照阳性。志贺菌在LB琼脂平板上培养，挑取单菌落进行血清学鉴定。血清型鉴定使用日本生研公司志贺菌抗血清(Denka Seiken，Japan)和自制抗原表位MASF IV-1抗血清^[12]，采用经典的玻片凝集法。

TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶购自TaKaRa公司；多重PCR扩增试剂盒购自Qiagen公司；DNA回收纯化试剂盒为QIAGEN公司产品；染色体DNA提取试剂盒购自上海生工公司；其他试剂均为分析纯。

福氏志贺菌血清型多重PCR引物及其体系检测按照参考文献[13]进行。PCR条件为：94 ℃预变性15 min ；94 ℃变性30 s ，55℃退火30 s ，72℃延伸60 s ，共30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。

根据gtrI基因簇序列设计引物gtrIAB-U:TTA TTC ATT CGT TAG TGT GGT T ；gtrIAB-L:CCT TAT GTG TCT CAG TTT TGT C，对5株gtrI基因阳性的血清Y型菌株进行扩增。扩增产物包括完整的gtrI基因簇。PCR扩增产物经胶回收纯化后，送上海生物工程公司测序，并与已经公布的gtrI基因簇基因序列(GenBank accession no. JX509734)进行比对。

福氏志贺菌基因组PFGE分析按照参考文献[14]进行。基因组DNA用NotⅠ进行酶切，电泳在1% SKG上进行，电压6.0 V/cm，脉冲夹角120°，起始脉冲时间3 s，终止脉冲时间30 s，电泳时间18 h。完成电泳后，胶放入1 μg/ml溴化乙锭染色30 min，置纯水中脱色30 min，凝胶成像系统中成像。PFGE图像应用BioNumerics 4.0 数据库软件(AppliedMaths BVBA，Belium)进行处理和识别图像条带，聚类图类型运用非加权配对数学平均法(UPGMA)构建，采用Dice系数衡量PFGE带型之间的相似度。

对19972010年全国细菌性痢疾监测收集的2000余株福氏志贺菌进行血清型多重PCR检测，并与血清型玻片凝集结果进行比对。结果发现，有5株血清型Y菌株除了福氏志贺菌特征性wzx基因(782 bp)扩增阳性外，gtrI基因(1122 bp)扩增也阳性(图 1)，但是I型抗血清凝集阴性；这5株菌除了与3(4)群抗血清凝集外，不与任何其他抗血清凝集，表现为血清Y型的特征(表 1)。其中3株(2002039、06HN364、10HN238)分别于2002、2006和2010年分离自河南；2株(06AH102、06AH120)于2006年分离自安徽。

图 1 携带gtrI基因簇5株血清Y型福氏志贺菌多重PCR扩增电泳结果 Figure.1 Multiplex-PCR detection of 5 S. flexneriserotype Y strains carrying gtrIgene 注：1. 阳性对照2001019 (1a)； 2. 阴性对照2003036(Y)； 3. 06AH102(Y)； 4. 06AH120(Y)； 5. 2002039(Y)； 6. 06HN364(Y)； 7. 10HN238(Y)。gtrI基因扩增长度为1122 bp，wzx基因扩增长度为782 bp。

图选项

采用引物gtrIAB对这5株菌株的gtrI基因簇进行扩增，结果5株菌株均得到全长2947 bp的扩增产物。扩增产物纯化后进行测序，测序结果与标准菌株的gtrI基因簇序列进行比对。结果发现，5株菌基因组中均含有gtrI基因簇序列，但是其中的gtrI基因存在功能失活性突变。菌株06HN364和06AH102的gtrI基因的1500位T碱基缺失，在编码蛋白序列500位产生终止密码子；菌株10HN238和06AH120的gtrI基因1175位A碱基缺失，在编码蛋白序列393位产生终止密码子；菌株2002039 gtrI基因的1512位T碱基缺失，在编码蛋白序列503位产生终止密码子(表 1)。与参考序列相比，gtrA和gtrB基因序列均未发现功能失活性突变。

对5株菌株进行PFGE分析，并与PFGE库中其他血清型福氏志贺菌进行聚类分析。结果发现，根据PFGE带谱，5株菌株可以分为5种不同的带型，但是都和血清1a型菌株具有相同或相近的带谱(图 2)。其中06AH102与1a血清型菌株05AH422、2005025、 2001038、06HN136具有相同的带谱；菌株10HN238与1a血清型菌株07HN162、08HN074、10HN128具有相同的带谱；菌株2002039与1a血清型菌株2002002和2002038具有完全相同的带谱。虽然没有发现与06HN364和06AH120带谱完全一致的菌株，但是他们与血清1a型菌株带谱相近，只有1条带的差异。这些结果提示这5株菌与1a血清型菌株的亲缘关系。

图 2 5株携带gtrI基因簇的Y血清型福氏志贺菌的PFGE带谱与1a血清型菌株的聚类关系 Figure.2 Relationship in clustering of PFGE patterns between 5 S. flexneri serotype Y strains carrying gtrIgene and serotype 1a strains

图选项

通过携带O抗修饰基因或基因簇的血清型转换噬菌体(SfI、SfII、Sf6、SfIV、SfV、SfX、SfIC)的溶原性转化^{[11, 15, 16, 17, 18, 19, 20]}，或携带的磷酸乙醇胺转移酶编码基因opt的质粒(pSFxv-1)^[4]，或携带乙酰基转移酶编码基因oacB、oacC的前噬菌体样结构^{[21, 22]}，介导在四糖骨架不同糖基上通过不同方式链接乙酰基、糖基或磷酸乙醇胺基团，在细菌表面形成抗原表位Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、3;4、6、7;8、9、10、1C 和MASF Ⅳ-1^[7]。不同抗原表位的组合形成了福氏志贺菌多样的血清型，这是福氏志贺菌血清型产生的分子机制。

本研究发现，5株福氏志贺菌Y血清型菌株中含有gtrI基因簇(gtrA，gtrB，gtrI)，但是其中的gtrI基因发生功能性失活突变，这造成I型抗原表位的缺失和I型抗血清的凝集阴性，表现为Y血清型的特征；PFGE分析发现这5株菌与本实验室保存的福氏志贺菌血清型1a菌株具有相同或相似的PFGE带谱，提示这些菌株原来可能是血清1a型，在进化过程中通过gtrI基因的突变回复到Y血清型。

既往研究发现，福氏志贺菌O抗修饰基因突变导致的血清型回复突变也存在其他血清型中。Chen 等^[23]在一株Y血清型菌株中发现gtrII基因簇，但是其中的gtrII基因发生失活突变；Roberts等^[24]发现血清型Y菌株SFL124基因组中携带SfII前噬菌体基因组，但是其中的gtrII基因存在插入突变，导致功能失活；本研究也发现，在部分血清型Y和X菌株中，携带功能失活的gtrII基因；提示他们来源于2a、2b血清型菌株^{[9, 13]}。另外，在一株5a血清型菌株中，笔者也发现携带功能失活的oac基因^[13]，导致群抗血清6凝集阴性，提示这株菌与3b血清型的渊源。此外，O抗修饰基因功能失活突变也在opt、oacB和oacD基因中发现，导致MASF Ⅳ-1 9和10抗原表位的缺失^{[21, 25]}。这些结果提示福氏志贺菌O抗修饰基因突变失活造成的血清型转换是一种比较常见的现象，应该引起重视。