疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (1): 8-13

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刘永华, 冯云, 尹小雄, 杨召兰, 李萍, 张智萍, 尹正留, 张海林
LIU Yong-hua, FENG Yun, YIN Xiao-xiong, YANG Zhao-lan, LI Ping, ZHANG Zhi-ping, YIN Zheng-liu, ZHANG Hai-lin
2014年云南省瑞丽市登革1和2型病毒流行的分子流行病学研究
Molecular epidemiology of dengue virus types 1 and 2 in Ruili, Yunnan, 2014
疾病监测, 2016, 31(1): 8-13
Disease Surveillance, 2016, 31(1): 8-13
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.01.004

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收稿日期: 2015-08-26
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刘永华, 冯云, 尹小雄, 杨召兰, 李萍, 张智萍, 尹正留, 张海林. 2014年云南省瑞丽市登革1和2型病毒流行的分子流行病学研究[J]. 疾病监测, 2016, 31(1): 8-13.
LIU Yong-hua, FENG Yun, YIN Xiao-xiong, YANG Zhao-lan, LI Ping, ZHANG Zhi-ping, YIN Zheng-liu, ZHANG Hai-lin. Molecular epidemiology of dengue virus types 1 and 2 in Ruili, Yunnan, 2014[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(1): 8-13.
2014年云南省瑞丽市登革1和2型病毒流行的分子流行病学研究
刘永华1, 冯云2, 尹小雄1, 杨召兰1, 李萍1, 张智萍1, 尹正留1, 张海林2     
1. 瑞丽市疾病预防控制中心, 云南 瑞丽 678600;
2. 云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室, 云南 大理 671000
收稿日期: 2015-08-26
作者简介: 刘永华,男,云南省梁河县人,大学本科,副主任医师,主要从事传染病预防控制工作冯云,女,云南省大理市人,硕士,副主任医师,主要从事虫媒病毒及自然疫源性疾病防治研究工作
作者贡献: 张海林、刘永华、冯云：项目设计和论文撰写
刘永华、尹小雄、杨召兰、李萍、张智萍、尹正留、张海林：流行病学调查、标本采集和DENV-NS1抗原检测
冯云、张海林：分子生物学检测和序列分析
通信作者: 张海林,Tel:0872-2196147,Email:zhangHL715@163.com
摘要: 目的 阐明云南省中缅边境的瑞丽市2014年登革热流行的登革病毒血清型及分子流行病学特点。方法 收集登革热病例资料, 采集患者急性期血清标本, 用RT-PCR法检测登革病毒核酸, 并进行登革病毒C/PreM区核苷酸序列测定和分析。结果 2014年6-12月, 瑞丽市共确诊登革热病例292例, 其中本地感染病例139例(47.77%), 输入性病例153例(52.23%;缅甸输入152例, 广州输入1例)。2014年瑞丽市登革热本地感染病例发病率为72.77/10万。主要流行地区为瑞丽市城区、姐告开发区和勐卯镇。经登革病毒核酸检测和序列测定, 从患者血清中获得65株病毒的C/PreM区基因核苷酸序列, 其中本地感染40例, 缅甸输入25例。进化分析表明, 登革1型病毒53株(本地感染31例, 缅甸输入22例), 2型11株(本地9例, 缅甸输入2例), 4型1株(缅甸输入病例), 它们均与东南亚登革病毒流行株具有较近的亲缘关系。结论 2014年瑞丽市发生了输入性和本地感染并存的登革热流行, 缅甸木姐市和中国瑞丽市均存在登革1和2型病毒的共同流行, 来自缅甸木姐市的登革热输入性病例是引起瑞丽市登革热本地流行的主要原因。
关键词: 登革热    登革病毒    血清型    进化分析    分子流行病学    
Molecular epidemiology of dengue virus types 1 and 2 in Ruili, Yunnan, 2014
LIU Yong-hua1, FENG Yun2, YIN Xiao-xiong1, YANG Zhao-lan1, LI Ping1, ZHANG Zhi-ping1, YIN Zheng-liu1, ZHANG Hai-lin2     
1. Ruili City Center of Diseases Control and Prevention, Ruili, Yunnan 678600, China;
2. Yunnan Institute of Endemic Diseases Control and Prevention/ Yunnan Provincial Key Laboratory for Zoonosis Control and Prevention, Dali, Yunnan 671000, China
Abstract: Objective To understand the serotype of dengue virus and molecular epidemiologic characteristics of an outbreak of dengue fever in Ruili, a city in Sino-Myanmar border area, in Yunnan province in 2014. Methods The incidence data of dengue fever in Ruili were collected. Serum samples from the dengue fever cases in acute phase were collect to detect the viral nucleic acid by using RT-PCR assay. The phylogenetic tree was constructed according to the nucleotide sequence of C/PreMgene fragments of dengue viruses. Results A total of 292 cases of dengue fever were laboratory confirmed in Ruili from June to December, 2014, in which 139 were indigenous cases(47.77%), 153 were imported cases (52.23%), i.e., 152 from Myanmar and 1 from Guangzhou of China. The local incidence of dengue fever was 77.69/lakh. The disease mainly occurred in urban area, Jiegao development zone and Mengmao town of Ruili. The results of viral nucleic acid detection and sequencing indicated that the nucleotide sequences of C/PreM region of 65 virus strains were obtained, including 40 local strains and 25 imported strains from Myanmar. The phylogenetic tree indicated that 53 strains belonged to serotype 1 (31 local strains and 22 imported strains from Myanmar), 11 strains belonged to serotype 2 (9 local strains and 2 imported strains from Myanmar) and 1 strain belonged to serotype 4 (from Myanmar). All the 65 strains shared high homology with the strains from Southeast Asia countries. Conclusion In the outbreak of dengue fever in Ruili in 2014, both indigenous cases and imported cases were detected. Dengue virus serotype 1 and 2 circulated in both Mujie of Myanmar and Ruili of China in 2014.The transmission of dengue fever from Mujie of Myanmar to Ruili of China was the main cause of local dengue fever epidemic.
Key words: Dengue fever    Dengue virus    Serotype    Phylogenetic analysis    Molecular epidemiology    

登革热(dengue fever,DF)是由登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播，病毒可分为4个血清型(1、2、3和4型)。近10年来，全球DF流行日趋严重，尤其是东南亚地区[1, 2]。在我国，广东、云南等省因输入引发的本地暴发疫情时有发生[3, 4, 5, 6, 7, 8]，2013年，西双版纳州景洪市和德宏州瑞丽市分别首次发生较大规模本地暴发疫情[9, 10]。2014年全国报告DF病例46 863例，出现死亡病例6例[11]，云南省瑞丽市也再次发生本地病例暴发流行。本研究对患者血清标本进行DENV核酸检测以及基因序列测定与分析，以期阐明DENV流行株的血清型及流行病学特点。

1 对象与方法 1.1 病例资料

DF病例资料来源于瑞丽市疾病预防控制中心(CDC)的DF病例个案调查表和流行病学调查资料，所有病例信息均上报到中国CDC疫情信息报告网络系统。根据中华人民共和国卫生行业标准－登革热诊断标准(WS 216－2008)[12]和中华人民共和国卫生和计划生育委员会印发的《登革热诊疗指南》(2014年第2版)对病例进行诊断，所有DF病例均为实验室诊断病例。

1.2 病例定义

输入性病例：指本地无DF流行，发病前15 d内来自或到过有DF流行的国家或地区、有蚊虫叮咬史的DF病例。本地感染病例：指发病前15 d内未离开过瑞丽市或未到过DF流行的国家或地区的DF 病例。

1.3 标本采集

采集DF 疑似和临床诊断病例的急性期(发病后0～5 d)血清。无菌真空采集患者静脉血液，经3000 r/min离心5 min，血清置于2 ml螺旋盖冻存管，立即进行DENV抗原检测，其余血清标本保存于－70 ℃冰箱。所有标本的DENV-NS1抗原检测均在瑞丽市CDC完成；分子生物学检测在云南省地方病防治所病毒实验室完成。

1.4 DENV-NS1抗原检测

NS1抗原检测试剂为美国CTK生物有限公司产品。按说明书操作，在检测卡上标记病例编号，取1滴血清或全血滴在加样孔中，加1滴缓冲液到加样孔中，25 min内读取结果。当质控区和样本区均出现条带时则判为阳性；仅质控区出现条带，而样本区未出现条带则判为阴性；如质控区未出现条带则试验无效。如在急性期血清中检测到DENV-NS1抗原，表明该患者感染了DENV。根据《登革热诊疗指南》，本法用于DF病例的确诊。

1.5 DENV RT-PCR试验

用QIAamp Viral RNA Mini Kit(美国QIAGEN公司)提取患者血清中的病毒RNA，用Amersham Bioscience Ready-To-GoTM You Prime First-Strand Beads(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)制备cDNA。取2 μl cDNA做反应模板，以D1(TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G)和D2 (TTG CAC CAA CAG TCA ATG TCT T-CAG GTT C)为引物[12, 13]，PCR扩增C/PreM区段基因(511 bp)。反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，扩增9个循环后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s(每个循环增加10 s)，扩增25个循环，68 ℃延伸10 min。反应结束后，取2 μl产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如果条带分子质量与预期片段大小相同，表明为相应的DENV核酸扩增阳性。

1.6 序列测定和分析

本研究中所有PCR扩增产物的测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。采用ClastalX 1.83软件进行核苷酸序列比对，采用Mega 5.0软件邻接法(neighbor-joining,NJ)进行DENV基因核苷酸序列系统发生树分析。本研究引用GenBank中来自不同国家和地区、不同年代的56株DENV C/PreM区段核苷酸序列，其中1型24株，2型20株，3型4株，4型8株，外群为流行性乙型脑炎病毒(JEV-P3/JEU47032)。

2 结 果 2.1 流行概况

2014年6月12日瑞丽市报告本年度首例输入性DF病例，7月23日发现本年度首例本地感染DF病例，随后发病数不断上升，疫区范围不断扩大，主要流行区为瑞丽市城区、姐告开发区和勐卯镇，直至11月发病数逐渐下降，主要流行期为8 10月(占84.25%)，末例本地感染病例发病时间为11月10日，末例输入性病例发病时间为12月25日，流行期176 d，其中本地流行持续 111 d，输入性病例持续176 d。共确诊292例DF，其中本地感染139例(47.77%)，输入性病例153例(52.23%；缅甸输入152例，广州输入1例)，无死亡病例。2014年瑞丽市DF发病率为 152.87/10万，而本地感染病例的发病率则为72.77/10万。

2.2 DENV核酸检测和序列测定

采用RT-PCR试验，选择100例DENV-NS1抗原阳性患者的血清标本进行DENV核酸检测，结果阳性65例，经序列测定获得这65例患者标本的DENV-C/PrM区基因核苷酸序列。这65例患者中，6月1例(输入首例)，7月1例(本地首例)，8月20例(本地18例，输入2例)，9月18例(本地12例，输入6例)，10月15例(本地8例，输入7例)，11月10例(本地1例，输入9例)。其中包括2014年首例输入性病例(2014-06-07)和首例本地感染病例(2014-07-31)以及本地 流行末期的本地感染病例(2014-11-01)。

2.3 DENV-C/PrM区的系统进化分析

从瑞丽市2014年DF患者血清中获得的65株DENV C/PrM区基因片段核苷酸序列与来自GenBank中不同国家和地区的56株登革病毒1型(DENV-1)、2型(DENV-2)、3型(DENV-3)和4型(DENV-4)代表株相应区段核苷酸序列构建系统进化树。结果表明，瑞丽市65株DENV(图 1中黑色小三角形代表 2014年瑞丽65株DENV)分别属于DENV-1、2、4型，其中53株为DENV-1型(图 1中黑色大三角形代表 2014年瑞丽53株DENV-1及该型参考株)；11株为DENV-2型(图 1，黑色圆形代表 2013年瑞丽检测到的DENV-2)；1株为DENV-4型(图 1)。结果表明，2014年瑞丽市存在1、2和4型DENV的流行，这三个型登革病毒中均在输入性病例中发现，其中1和2型病毒同时引起本地流行。

图 1 瑞丽市2014年65株登革病毒与来自GenBank 中55株登革1、2、3和4型病毒的C/PrM区核苷酸序列系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic trees based on C/PrM gene of 65 DENV strains isolated in Ruili in 2014 and 55 strains of DENV-1, 2, 3 and 4 from GenBank
图选项

为进一步分析引起瑞丽市2014年DF流行的DENV来源，笔者用这65株DENV与来自东南亚等地区的56株登革各型病毒构建系统进化树。瑞丽市2014年53株DENV-1可分为两个进化亚支(图 2，黑色三角形代表 2014年瑞丽流行的DENV-1；黑色圆形代表 2013年瑞丽DENV-1)，它们之间存在一定差异，可能属于两个流行株系，其中一个株系与2013年流行株同处一个分支。另外，这2个亚支中各自都存在着与其他多数流行株有一定差异的病毒株；还发现在这2个进化亚支外，RLDEN1454株单独处于一个小分支。进化分析还显示，虽然瑞丽市这53株DENV-1可以分为2个或3个进化支，但均与缅甸(AY726553、AY726550、AY726555、AY713475)、泰国(AY732479、AY732478、HM469967和JN638344)不同时期流行株亲缘关系最近，并与柬埔寨(GU131923、JN819423和HM631852)和马来西亚(JN697058和JN697057)流行株也有较近的亲缘关系，而与印度(JN903580、JN903581和KF289072)流行株进化关系稍远。

图 2 瑞丽市2014年53株登革1型病毒与来自GenBank 中19株登革1型病毒的C/PrM区核苷酸序列系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic trees based on C/PrM gene of 53 DENV-1 strains isolated in Ruili in 2014 and the 19 strains of DENV-1 from GenBank
图选项

DENV-2进化分支显示，瑞丽市2014年11株DENV-2也可分为2个进化亚支，它们之间也有差异，属2个流行株系。进一步分析发现，这11株DENV-2均与越南(FM210214、FM210242、JQ045672)、泰国(GQ868544、DQ181797、DQ181806、DQ181803和NC001474)和柬埔寨(KF955402、GQ868622、JN368476、GU131927、FJ639697和FJ639698)流行株具有较近的亲缘关系，见图 1。

DENV-4进化分支显示，瑞丽市2014年1株DENV-4与泰国(AY618991和AY618988)和柬埔寨(KF955510)流行株具有较近的亲缘关系(图 1)。

2.4 各型DENV病例的时间分布

感染DENV-1的首例患者于6月出现，7月和8月流行株均为1型，且该型病毒贯穿于本次流行的全过程，属主要流行型。DENV-2患者最早于8月31日出现，且为本地感染病例，随后，9月(3例)和10月(4例)均有本地感染病例；11月4例中本地2例，缅甸输入2例。DENV-4仅从1例来自缅甸的输入性病例中检测到，发病时间为11月8日。

2.5 各型DENV病例的感染地分布

获得DENV序列的65例患者中，本地感染40例，缅甸输入25例。其中，在感染DENV-1的53例患者中，本地31例，缅甸输入22例；2型11例患者中，本地9例，缅甸输入2例；4型1例为缅甸输入病例。

3 讨 论

云南省瑞丽市为中缅边境地区的重要沿边开放城市，与缅甸木姐、南坎和九谷市接壤，生态环境相似，瑞丽市姐告口岸为我国连接东南亚和南亚地区的重要陆路通道，出入境人员和交通工具流动性较大，两国边民往来频繁。近年来，瑞丽市DF输入性病例不断增多，如2008年45例，2013年87例，2014年153例，且绝大多数来自缅甸木姐市[8, 10]。埃及伊蚊和白纹伊蚊在瑞丽市分布广泛，具备登革病毒快速传播的条件，疫情流行风险受缅甸尤其是紧邻的木姐疫情影响大。2013年瑞丽市首次发生DF本地流行以及2014年再次发生流行强度较大的DF均与来自缅甸木姐的输入性病例密切相关[10]。本研究DENV的分子进化分析表明，瑞丽市53株1型、11株2型和1株4型DENV与缅甸、泰国、越南和柬埔寨等东南亚国家的同型DENV流行株亲缘关系最为接近，提示引起瑞丽市DF暴发的病原来源于这些地区。流行病学调查确认，瑞丽市DF输入性病例多来自缅甸，并贯穿整个流行期，并且从来自缅甸的输入病例中检测到DENV-1、DENV-2和DENV-4病毒，其中，DENV-1和DENV-2还造成本地感染流行。这与缅甸等东南亚国家存在4个血清型DENV的流行的现状相符[14, 15]。2014年瑞丽市65株DENV中，1型有53株，占81.54%，属主要流行株。进化分析还发现，2014年1型流行株间存在一定差异，可分为2个进化亚支，其中1个亚支与2013年流行株亲缘关系较近，提示存在该病毒株跨年传播的可能性。

缅甸DF防控措施落实多较差，对云南DF防控造成较大压力，瑞丽市存在DF再次流行或大流行的风险，并有可能形成地方性流行区，因此，加强中缅两国边境地区DF联防联控工作是当前面临的重要任务。

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