人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)属于细小病毒科，博卡病毒属。2005年瑞典学者在儿童下呼吸道感染病例中首次发现该病毒^[1]。目前，有3种亚型博卡病毒HBoV1、HBoV2、HBoV3、HBoV4 被报道^{[2, 3, 4]}。博卡病毒感染主要引起儿童急性上呼吸道感染、支气管炎、肺炎等，少部分患儿伴有腹泻症状。有研究表明，北京地区部分儿童急性呼吸道感染与HBoV有关，并且低年龄组儿童中HBoV感染更为常见^[5]。为全面了解北京地区儿童HBoV的感染状况，笔者于2013-2014年对北京地区6岁以下学龄前儿童急性呼吸道感染病例进行HBoV监测研究，以掌握该病毒的感染状况和流行特征，为制定预防控制策略提供科学依据。

北京市疾病预防控制中心于2013年1月至2014年12月在北京市16区(县)28家哨点医院采集6岁以下儿童急性呼吸道感染病例的咽拭子、痰液标本共5623份，其中2013年采集3338份，2014年采集2285份。标本收集后置-80 ℃冰箱保存。

使用TtThermo Scientific KingFisher Flex核酸自动提取仪、ThermoFisher Lab Serv病毒RNA纯化试剂盒提取标本中的病毒核酸，按说明书操作。

采用呼吸道病毒核酸多重实时荧光PCR检测试剂盒(江苏合创生物有限公司)检测博卡病毒及其他常见呼吸道病毒，包括甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1~4型、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、鼻病毒、腺病毒和冠状病毒^[6]。荧光PCR反应在ABI7500荧光PCR仪上进行，反应条件按试剂盒说明书进行。

博卡病毒检测阳性标本，采用巢式PCR扩增博卡病毒VP1片段进行基因分型。第一轮引物AK-VP-F1( 5′-CGC CGT GGC TCC TGC TCT-3′) 和AK-VP-R1 (5′-TGT TCG CCA TCA CAA AAG ATG TG-3′)，第二轮引物AK-VP-F2 (5′-GGC TCC TGC TCT AGG AAA TAA AGA G-3′) 和AK-VP-R2 (5′-CCT GCT GTT AGG TCG TTG TTG TAT GT-3′) ^[3]。扩增片段大小为576 bp。引物由上海生工有限公司合成。PCR试剂盒采用美国Invitrogen 公司的Platinum^® Taq DNA Polymerase。

反应条件：第一轮： 94 ℃ 3 min，94 ℃ 35 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环10次(每个循环降0.5 ℃)； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环30次； 72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞。 第二轮：94 ℃ 3 min，94 ℃ 35 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环10次(每个循环降0.5 ℃)； 94 ℃ 30 s ，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循环30次； 72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞。 扩增反应在ABI 9700 PCR仪上完成。PCR 操作严格质控，设立提取对照、空白对照、阴性对照，并严格分区操作，所有样本和核酸加样都在生物安全柜中进行。

PCR扩增阳性产物送上海生工进行双向测序，采用DNAStar软件进行正反向序列的拼接，采用BioEdit软件进行序列比对，采用Mega 5.0软件进行进化分析。

基因分型所选择GenBank中HBoV各亚型参考株如下：HBoV1 ST1(DQ000495)、HBoV1 ST1(DQ000496)、HBoV2型W153(EU082213)、HBoV2型PK-2255(FJ170279)、HBoV2型TU-A-114-06(FJ973558)、HBoV2B型NI327(FJ973559)、HBoV2B型NI213(FJ973560)、HBoV3型W471(EU918736)、HBoV3型NI374(FJ973563)、HBoV4型NI385(FJ973561)、HBoV4型US-MN-964-05(GQ506568)。

数据录入Excel 2007软件，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，阳性检出率比较采用χ²检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2013-2014年共采集6岁以下儿童急性呼吸道感染病例标本5623份，HBoV检测阳性38份，阳性检出率为0.68%。其中2013年采集3338份，HBoV检测阳性26份，阳性检出率为0.78%；2014年采集2285份，HBoV检测阳性12份，阳性检出率为0.53%。

不同年龄组的检出情况：0~岁组婴幼儿阳性检出率为0.88%，1~岁组儿童阳性检出率为1.00%，4~6岁组儿童阳性检出率为0.34%。3岁以下儿童(包括0~组、1~3岁组)阳性检出率为0.96%(29/3011)，比3岁以上儿童组HBoV检测阳性率高(0.34%)(χ²=10.058，P=0.001)，见表 1。

2013年不同月份HBoV检出情况：3月阳性检出率为0.48(1/208)，8月为0.90%(2/221)，9月为1.52%(4/263)，10月为2.00%(9/449)，11月为1.52%(8/524)，12月为0.35%(2/567)，其余月未检出。流行季节为8-11月，高峰期为10月。

2014年不同月份HBoV检出情况：3月阳性检出率为0.19%(1/519)，5月为0.57%(2/348)，8月为5.56%(4/72)，9月为1.14%(1/88)，10月为3.41%(3/88)，其余月未检出。流行季节为8-10月，高峰期为8月。

图 1 2013-2014年北京地区6岁以下儿童急性呼吸道感染病例HBoV时间分布 Figure 1 Time distribution of HBoV detection in children aged < 6 years with acute respiratory tract infection in Beijing, 2013-2014

图选项

38例HBoV感染病例中有7例为HBoV与其他病毒混合感染，混合感染率为18.42%(7/38)。其中2例为HBoV与冠状病毒混合阳性，2例为HBoV与副流感3型病毒混合阳性，1例为HBoV与呼吸道合胞病毒混合阳性，1例为HBoV与鼻病毒混合阳性，1例为HBoV、鼻病毒和腺病毒3种病毒混合阳性。

38份HBoV阳性标本经序列测定均属于HBoV1型，与参考株HBoV1 ST1和ST2株(GenBank序列号为DQ000495、DQ000496)核苷酸同源性98.4%~99.6%，氨基酸同源性98.2%~100.0%。进化树分析见图 2。

图 2 北京地区HBoV VP1片段(503 bp)序列进化树分析 Figure 2 Phylogenetic tree of VP1 fragment (503 bp) of HBoV in Beijing 注： * 标记序列为参考株及国内代表株。

图选项

2006年瞿小旺等^[7]国内首次报道从急性呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物中检测出HBoV，国内外陆续报道了HBoV的感染情况^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}，这些报道大多数基于当地1~2家医院的儿科病例进行研究。本研究选择北京市16个区(县)28家医院作为HBoV监测哨点医院，对6岁以下急性呼吸道感染患儿系统地开展HBoV监测，较全面地揭示了HBoV在北京地区儿童中的感染状况和流行特征，为更深入地研究HBoV奠定了基础。

目前研究表明，HBoV1可感染不同年龄段人群，但主要集中在5月龄至5岁儿童中，尤其以6月龄至2岁婴幼儿为多发^{[5, 14, 15]}。本研究中北京地区HBoV阳性检出病例的最小年龄为4月龄婴儿，3岁以下患儿检出阳性率高于3岁以上患儿 (χ²=10.058，P=0.001)，与国内外研究结果一致。HBoV感染可在全年发生，但在深秋、冬季和早春天气较冷的季节多发 ^{[1, 8, 9]}。在欧美HBoV感染主要集中在冬春季节^{[1, 9]}，韩国多发于晚春^[10]。Zhou等^[13]报道重庆地区HBoV1在夏季有很高的检出率。曹长青等^[16]报道兰州地区HBoV1型在5-8月和11-12月有检测高峰。本研究中北京地区HBoV1型的检测高峰主要集中于每年8-11月。说明不同国家、不同气候区域HBoV季节特征可能有所不同，需要进一步持续监测发现季节流行规律。

本研究中HBoV混合感染占比为18.42%，包括冠状病毒OC43/NL63、副流感3型、呼吸道合胞病毒、鼻病毒及腺病毒。由于HBoV混合感染率较高，因此其在呼吸道感染中的致病作用备受争议。Zhao等 ^[17]在其研究中证实有呼吸道感染症状的患儿HBoV病毒载量较无症状儿童高。在呼吸道感染患儿中HBoV与其他病毒混合感染较HBoV单独感染可加重疾病程度，越来越多的研究证实HBoV1感染在呼吸道感染致病机制中起协同作用^[18]。HBoV真正的致病作用还需要进一步的临床和流行病学研究来确定。

本研究中所有HBoV阳性标本基因分型均为HBoV1型，未检出其他型别，表明北京地区6岁以下儿童急性呼吸道感染病例以HBoV1型为主。上海、广州、兰州等地呼吸道感染患儿中HBoV同样以HBoV1型为主^{[16, 19, 20]}。同源性分析显示核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~99.6%，氨基酸同源性98.2%~100.0%，高度保守。