流行性感冒是由流感病毒引起的，具有高度传染性的急性呼吸道疾病，其中以甲型流感病毒对人类危害最大，曾多次引起世界性的大流行^[1]。甲型流感病毒极易发生变异，近年来新的亚型病毒不断出现，至今发现的能直接感染人类的常见亚型有H1、H5、H7、H9等，其中以H1N1、H5N1和H7N9致病性最高^{[2, 3, 4]}。截至2015年3月，全国共报告511例H7N9，死亡209例^[5]。浙江省德清县是禽流感的高发地区，从2013年4月首次确诊2例H7N9起，之后每年均有新发病例出现，因此检测该地区自然人群中禽流感病毒抗体情况，不仅能够反映当地疫情的实际情况，还能及时了解该地区居民的免疫水平，为相关政策的制定提供客观的依据。另外，流感病毒变异性强，而流感疫苗的研制往往具有滞后性，了解各病毒亚型之间的关联，探索它们之间是否具有交叉保护作用，对新疫苗的研制和禽流感防控具有重要的意义^[6]。本研究利用现有生物样本库，检测了德清县农村社区一般人群的禽流感病毒H7N9、H9、H5、甲型H1N1和季节性流感病毒H3、H1的血清抗体滴度，并探索各病毒亚型之间的关联。

2013年4月，德清县首次报告2例H7N9病例，笔者分别在急性期和恢复期对患者及其14名密切接触者进行H7N9血清抗体检测；同时，利用现有的生物样本库(该生物样本库采用随机整群抽样的方法，于2006-2014年分阶段抽取德清县8个乡镇65个农村社区，由当地经过统一培训的社区医生对18岁以上户籍居民进行体格检查并采集血样，置-80 ℃保存)，抽取病例所在社区的1228份自然人群的血清进行H5、H9、H7N9抗体检测(其中725份血清收集于疫情出现之前的2012年6-8月，503份血清收集于疫情发生之后的2013年6-8月)。同时在病例发生之后收集的503份血清中，抽取398份血清进行了季节性H1、H3和甲型H1N1抗体检测。

A/California/07/2009 (H1N1)、 A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Brisbane/10/2007 (H3N2) 标准抗原由上海生物制品研究所制备。禽流感病毒H7N9、H5、H9标准抗原及抗血清由农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

血清在测定前用常规霍乱滤液(RDE)处理以去除非特异性抑制物，使用鸡红细胞吸附以去除非特异性凝集素。然后用常规的血凝抑制试验(HI)半加敏法进行测定。对于季节性流感病毒H1、H3和甲型H1N1，结果判断以血凝抑制滴度≥1：40为阳性;对于H7N9、H9、H5禽流感病毒，结果判断以HI≥1：20为阳性。

在EpiData 3.0软件中建立数据库，应用SPSS 19.0软件进行数据分析；分别计算甲型流感病毒各亚型的抗体阳性率和几何平均滴度(GMT),以2010年中国标准人口结构对抗体阳性率进行年龄标化；年龄组之间阳性率比较用趋势χ²检验；关联分析采用配对χ²检验(McNemar)并计算关联系数r。以P < 0.05(双侧检验)为差异有统计学意义。

本次研究对所有H9、H7阳性标本进行了复测，其结果也均为阳性；并随机选择100份血清对H1、H3、甲型H1N1进行了复测，结果一致性为99%。

2013年4月浙江省德清县首次确诊2例H7N9。对其14名密切接触者的血清抗体检测发现，在急性期患者家属的血清中均未发现H7N9抗体，而在恢复期，2例患者各有1名家属检测出H7N9抗体，感染率为14.3%，见表 1。

疫情出现之前，一般人群中未检测到H7N9的保护抗体，而病例出现之后，检测到1例隐性感染患者，抗体阳性率为0.2%。对于H5，病例出现前后在人群中均未发现其抗体。H9抗体阳性率在4%~5%之间，病例出现前后变化不大 (P>0.05)，见表 2。

2013年6月共有503名居民检测了H7N9、H9、H5，有15人检测出H7N9抗体，但仅有1人达到阳性标准，阳性率为0.19%；有99人检测出H9亚型抗体，仅22人抗体滴度≥1：20，阳性率为4.19%，标化率为4.18%；未发现有居民血清中H5的抗体滴度超过1：20。在398名同时检测了季节性H1、H3流感病毒和甲型H1N1流感病毒抗体的居民中，甲型H1N1抗体阳性率为4.77%(19/398)，标化率为5.73%; 季节性流感病毒H1和H3抗体阳性率分别为5.28%(21/398)和11.31%(45/398),标化率分别为7.86%和6.28%，见表 3。

H9和甲型H1N1在各年龄组之间差异无统计学意义(P>0.05)，抗体阳性率在3%~7%之间波动。虽然季节性流感病毒抗体阳性率在各年龄组之间差异也无统计学意义 (P>0.05)，但18~50岁人群H1抗体阳性率明显高于70岁以上人群，而季节性H3却相反，见表 4。

交叉免疫试验发现1例H7N9隐性感染者，其血清中甲型H1N1、季节性H1、H3抗体也同时为阳性；关联分析显示(表 5)，季节性H1、H3抗体阳性者，甲型H1N1抗体也趋向于阳性(P < 0.05)，其中季节性H3和甲型H1N1之间存在弱相关(r=0.111),而甲型H1N1和季节性H1之间存在较强相关(r=0.504)。同时发现甲型H1N1和H9之间也存在关联(P < 0.05),甲型H1N1抗体阳性者H9血清抗体也趋向阳性，但关联较弱(r=0.108)。

2013年4月德清县首次出现2例H7N9患者，在对患者及其家属的血清抗体动态检测中，发现2例患者均有1名家属出现隐性感染，与广东省报道的家族聚集性疫情相一致^[7]，可能是由于他们共同的活禽市场暴露导致的，但2名家属血清抗体的出现时间均晚于患者，因此不能排除H7N9在人与人之间传播的可能^[8]。同时研究发现密切接触人群中H7N9的感染率为14.3%(2/14)，远高于自然人群中的0.2%^[9]，提示加强病例及密切接触者监测，规范活禽市场管理可以有效地控制人感染H7N9禽流感疫情。

本次研究未发现H5型病毒抗体，与山东、广东等地区相同^{[9, 10]}，提示到目前为止德清县尚未有大规模的H5N1禽流感暴发疫情，但鉴于H5N1型病毒致病性强，病死率高，同样不能轻视。同时本研究结果显示，德清县农村社区H9亚型抗体阳性率为4.19%，高于2006年广东省的2.2%和2009年上海市的2.4%^{[8, 11, 12]}，研究证实H9亚型病毒广泛存在于禽类中，而德清县是候鸟重要的迁徙基地，因此要加强候鸟迁徙地区和活禽市场的监测，可以有效避免H9型禽流感病毒的局部暴发。一般而言，当自然人群流感病毒抗体阳性率高于60%时，即可抵御流感病毒的侵袭，不易造成流行 ，本次研究发现德清县农村人群中H1N1抗体阳性率为4.77%(标化率5.72%)，高于2008年全国平均水平1.2%^[13]，低于2009年11月江苏的16.9% 和 2010年8月的山东25.8%及广东等地区^{[14, 15, 16]}。提示2009年甲型H1N1流感已在德清县内广泛传播，但总体阳性率较低，人群免疫保护水平有限，有效免疫屏障尚未形成，甲型H1N1流感疫情再次暴发的风险依然存在。2013年6月德清农村社区一般人群对季节性H3、H1流感病毒的抗体阳性率分别为11.30%和5.30%(标化率分别为6.28%和7.86%)，远低于上海地区一般人群的82.80%和54.80%(以HI≥1：20为阳性)^[12]，提示对农村社区人群接种流感疫苗是很有必要的。

本次研究发现疫情出现前后自然人群中H7N9抗体阳性率极低，提示H7N9尚未在德清县内大规模暴发。对唯一1名H7N9隐性感染者的进一步血清学分析发现，该患者甲型H1N1、季节性H1、H3抗体也为阳性，提示H7N9与季节性流感病毒之间可能存在交叉免疫，但这之前的研究结论相反^{[17, 18]}，同时之前文献报道的H7N9通常混合感染H9N2在本研究中也没有发现^[19]，可能是由于本研究H7N9阳性病例较少，需要进一步研究。

本次研究发现甲型H1N1与季节性流感病毒H1、H3及与H9之间存在一定关联，甲型H1N1抗体阳性的患者，血清中季节性流感病毒及H9抗体也趋于阳性，推测可能有以下两个原因：(1)交叉免疫：目前已有研究证实季节性流感病毒与甲型H1N1之间存在交叉免疫^{[20, 21]}，但由于甲型H1N1与H9在核心的基因序列上有巨大差异，这两者之间是否存在交叉保护还需进一步研究证实。(2)共同的暴露环境：由于甲型H1N1、H9病毒和季节性流感病毒具有共同的暴露环境，当患者持续暴露于该环境中时，将同时或先后感染多种病毒，出现多种亚型病毒抗体阳性。目前国内外已有季节性流感病毒与甲型H1N1混合感染的相关报道^{[22, 23]}，但目前尚未发现H9与甲型H1N1的混合感染病例。

随着城镇化的发展，农村人口流失严重，特别是青壮年在外务农情况十分普遍，因此本次调查的人群与正常人群的结构有所差异，但这也真实的反映了当地农村现状及禽流感流行情况。对于血清学检测，笔者选择了部分阴性标本复测，对所有H9、H7阳性标本进行了复测，其结果均为阳性；对H3等部分阴性进行了复测，一致性达99%，可以忽略测量误差对实验结果的影响。

综上所述，德清县农村社区一般人群对H7N9和H5流感病毒没有免疫力，而对H9、甲型H1N1和季节性H3、H1免疫水平较低，存在暴发可能，建议加强监测。甲型H1N1和季节性流感病毒及H9可能存在交叉免疫，值得进一步证实。