随着科学技术的发展，自动化处理在许多实验室的日常工作中逐渐得到应用^[1]。自动化设备能够将人员从耗时的纯粹重复性的工作中解放出来，投入到更多的思考性工作中去，在多种行业中已经成为发展方向，例如制药行业、食品生产行业以及下一代基因组测序行业^{[2, 3]}。使用自动化处理设备不但极大地提高了劳动效率，更重要的是能够消除人工操作带来的误差和可能因为疲劳产生的错误。

病原体网络化监测是基于病原体分子分型的监测体系，通过研究病原体的特征从而实现暴发的鉴定、溯源和趋势预测，其中涉及大量的核酸操作。核酸提取与纯化是指通过化学方法得到微生物核酸的过程。其中涉及微生物的破碎、细胞碎片的去除、蛋白质的消化、化学物质的去除等步骤。目前来看，核酸的提取与纯化大致有4种方式。第一种方式是经典的手工提取法，该方法的优点是单次操作能够得到大量的高质量的核酸，缺点是耗时耗力，每个工作人员每天最多提取12~24个样品，另外，该方法使用大量的酚和氯仿，对操作人员的身体危害不容忽视。第二种方式是基于单个过滤柱的人工试剂盒提取法。目前市场上有多种可以供选择的品牌，价格不一，质量也参差不齐。该方法的优点是避免使用大量酚和氯仿，减少了对操作人员的身体危害；缺点是依然较为耗时耗力，一个操作人员平均每天最多能够完成24个样品的操作。第三种是基于96孔板，配合手工排枪操作的核酸提取与纯化方式。这些试剂盒中的大部分也配备各自相应的自动化操作系统。这种方式同样避免了使用大量的酚和氯仿，提高了工作效率。但也存在缺点，例如，这些系统通常是封闭的，表现在只能使用特定品牌的试剂盒，工作参数不易调整等。第四种方式是配套使用自动液体处理器与96孔板型的试剂盒。该方法的优势在于能够高通量、自动化或者半自动化的完成核酸提取与纯化，得到的核酸质量能够满足大多数实验的要求，而且通过能够灵活调整工作参数，从而使用多种品牌和型号(包括将来面世的新品牌和新型号)的96孔板型核酸提取与纯化试剂盒；缺点是获得到的核酸量较少。

细菌分子分型是指用分子生物学手段对细菌进行区分。目前常用的方法包括多位点可变重复序列分析(Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis，MLVA)、多位点序列分型(multi locus sequence typing，MLST)、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分型方法以及全基因组测序(Whole genome sequencing，WGS)方法。使用这些方法进行细菌分析的时候，涉及大量历史菌株的分析，需要建立数据库，便于查询比对，最终进行暴发溯源和菌株的亲缘分析^[4]。这些方法均涉及核酸的提取与纯化。传统的人工方法耗时、耗力且容易出错。这是省级(甚至某些市级)和国家级病原体网络化监测实验室工作中普遍遇到的棘手问题之一。为解决这个问题，笔者采取了上述的第三种核酸提取方案，配套使用自动化液体处理器与96孔板型核酸提取与纯化试剂盒进行核酸的提取与纯化。笔者实验室购置的自动液体处理器是一个通用型设备，并非单独针对核酸提取与纯化，没有成熟的方案可供使用。在本实验中确定了针对笔者选择的试剂盒以及操作的细菌的核酸提取与纯化的参数。使用本实验方法能够在6 h内完成96个细菌样品的核酸提取与纯化，得到的核酸能够满足上述3种实验的要求。

96孔板型核酸提取与纯化试剂盒(69581，Qiagen，批号：145047553)；蛋白酶K(ProteinaseK，Amresco，批号：8019B073)；RNA酶A(RNaseA，Promega，批号：0000118628)；丢弃型机械手枪头(RoboRack MDT 235，PerkinElmer，6001295)；自动液体处理器(Janus，PerkinElmer)；微量分光光度计(NanoDrop 1000，NanoDrop)。

使用1.5 ml的离心管以12 000 r/min离心收集菌体，共收集96个样品。

每个样品加入96孔板型核酸提取与纯化试剂盒中的ATL液体180 μl，随后加入蛋白酶K(100 mg/ml)5 μl，置于56 ℃水浴中，直至液体变清亮。将上述样品的温度降至室温，加入4 μl的RNaseA(100 mg/ml)，室温静置 5 min。将96个样品转移至96孔板型核酸提取与纯化试剂盒提供的96孔深孔板中。

将放置样品的96孔深孔板、96孔板型核酸提取与纯化试剂盒中的洗涤液AL、AW1、AW2、Elution buffer、含氯漂洗剂、超纯水、工作站专用235 μl枪头置于自动液体处理器的不同板位，经过蛋白处理、洗涤、真空抽滤、洗涤、真空抽滤、核酸溶解、真空抽滤7个步骤，最终得到溶解于100 μl的DNA。

使用NanoDrop测定所得核酸质量。

Qiagen的96孔板型核酸提取与纯化试剂盒虽然给出了每个样品中细菌数量的建议，但是不同细菌的蛋白质、多糖构成比的差异会导致细菌裂解和后续蛋白消化的效果产生差异。因此，笔者对不同细菌数量与核酸得量之间的关系进行了比较。结果显示：对于霍乱弧菌来说，如果液体培养物的浓度达到 10⁸ /ml，使用0.3 ml的培养物核酸的得量(>100 ng/μl)和质量(A₂₆₀/A₂₈₀～1.8)都是最高；使用0.4 ml培养物核酸的得量与使用0.3 ml培养物相当，但是核酸的质量下降(A₂₆₀/A₂₈₀>2.2)；使用0.5 ml或者更多的培养物，则有可能导致过滤膜堵塞从而无法进行后续实验的情况。对于甲型副伤寒沙门菌，如果液体培养物的浓度达到10⁸ /ml，那么0.5 ml的液体培养物核酸的得量(>100 ng/μl)和质量(A₂₆₀/A₂₈₀～1.8)都是最高的。

大量的核酸提取和纯化中，最重要的问题在于避免不同样品之间的交叉污染。样品之间的污染主要发生在细胞破裂后蛋白变性的过程中。使用自动液体处理器工作的第一步是加入含有蛋白变性剂的溶液，使核酸游离出来。此过程涉及多次混匀操作，有可能产生含有样品核酸的气溶胶。由于96孔板的空间限制，如果操作不当，极易发生气溶胶扩散导致的样品之间的交叉污染。因此，笔者对不同条件下交叉污染的状况进行了比较。在96(8行×12列)孔板中，在相邻列的所有孔中分别加入含有耐药基因的细菌培养物和不含有耐药基因的细菌培养物，使用不同的方案提取DNA后，使用PCR检测耐药基因，从而判断交叉污染率。结果吸纳时，样品之间的交叉污染率主要由3个因素决定：机械手枪头与液面之间的距离、气动活塞的移动速度以及每次混匀液体的体积。为了分别比较这3个参数对交叉污染率的影响，笔者分别固定2个参数，只改变第3个参数，观察该参数对交叉污染率的影响。通过比较不同参数的组合，得到两个交叉污染率最小的参数组合(表 1)。

自动液体处理器在使用过程中很大一部分运行成本在于可丢弃型机械手枪头的使用。使用这种枪头的目的是避免产生污染。为了最大限度地减少可丢弃型机械手枪头的使用，从而降低自动液体处理器的使用成本，笔者对核酸提取与纯化过程中使用可丢弃型机械手枪头的步骤进行了研究，发现使用自动液体处理器的步骤中，除了第一步(加入含有蛋白变性剂的溶液)的混匀步骤需要混合样品牵涉到样品DNA外，剩余的步骤都是使用可丢弃型机械手枪头加入不同的液体。在这些步骤中，96孔板型试剂盒提取手册中均要求使用新的可丢弃型机械手枪头，这样的要求是为了避免在加样过程中液体的冲击可能产生的气溶胶污染。为了尽可能地减少可丢弃型机械手枪头的使用，笔者在每一步加入洗涤液体的操作之后，加入了使用超纯水自动洗涤可丢弃型机械手枪头的步骤。这样减少了67%可丢弃型机械手枪头的使用量，从而降低了该体系的运行成本。

高通量、自动化核酸提取和纯化工作在20世纪90年代初就已经在国外多个主要的测序中心开始得到应用^[5]。之后，国际上有些开展细菌分型研究的参比实验室也开始建立半自动化的流程^[6]。在医院的检验实验室和各种“生物样品库”中，样品处理和保存的自动化呈现逐步提高的趋势^[7]。疾病控制和临床工作中，新的分型技术由于涉及大量手工操作，使得自动化成为一种需求。无论从工作效率还是从工作的可靠性来说，自动化是目前的一个趋势。笔者的课题涉及大量的MLVA和MLST工作，这些工作都涉及大量细菌样本的核酸提取与纯化工作，因此尝试建立半自动化的体系来完成这些工作。

对于核酸的提取与纯化，最重要的一个问题是避免样品之间的可能产生的交叉污染。在建立核酸提取与纯化体系的过程中，笔者着重解决这个问题。在笔者要构建的这个体系中，气溶胶是不同样品之间污染的最主要来源，而气溶胶主要是在样品的混匀过程中产生的。因此，在构建该提取与纯化体系的时候，笔者尝试比较气动活塞移动速度、每次混匀液体的体积以及可丢弃型机械手枪头与液面之间的距离对样品之间交叉污染率的影响。结果显示，自动液体处理器的气动活塞移动速度越快、每次混匀液体的体积越大、可丢弃型机械手枪头与液面距离为正数(可丢弃型机械手枪头在混匀液面之下，距离为负数；可丢弃型机械手枪头在混匀液面之上，距离为正数)，导致交叉污染率高；反之，交叉污染率则降低。这是因为自动液体处理器的气动活塞移动速度越快，形成的冲击气流就越大，产生气溶胶的可能性就越大；每次混匀液体的体积越大，形成的冲击液体体积就越大，产生气溶胶的可能性也就相应增大；而可丢弃型机械手枪头在混匀液体的时候若在液面之上(机械手枪头月液面的距离为正数)，则容易形成气溶胶，而且，形成的气溶胶更容易从样品孔中扩散到相邻的样品孔中，从而导致交叉污染。

除此之外，笔者还尝试解决半自动化过程中，使用可丢弃型机械手枪头过多，从而导致自动液体工作站运行成本过高的问题。由于要减少样品之间的污染，因此诸多自动液体处理器的生产厂家推荐使用可丢弃型机械手枪头。但是，自动液体处理器的可丢弃型机械手枪头的价格是同等规格的非液体工作站使用的滤芯枪头价格的2~3倍。这样不仅造成自动液体处理器的使用成本升高，更加大了塑料废弃物的产生，给环境保护带来更大的压力。除了混匀液体与蛋白变性液这一步之外，可丢弃型机械手枪头都不与样品核酸发生接触。因此，笔者在两个洗涤的步骤后面均加入了一步用超纯水洗涤可丢弃型机械手枪头的步骤。这样虽然延长了工作时间(约5 min)，但是却减少了67%可丢弃型机械手枪头的使用量，从而降低体系的运行成本。研究结果也显示，使用这两个洗涤的步骤的方案与使用新的可丢弃型机械手的方案，所产生的核酸的产量和质量相当。

本实验建立了高通量半自动化的细菌核酸提取与纯化工作体系，并优化了工作参数。使用优化的工作参数，该体系能够得到能用于绝大多数分子生物学研究的核酸；并且能够最大程度地避免产生样品之间的交叉污染。与传统的使用离心柱型的手工方法相比，该体系能够提高工作效率2.5倍，节约工作人员大量宝贵的时间，该方案可供各级病原体网络化监测实验室进行分子分型等工作使用。