疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (4): 346-350

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崔世恒, 付士红, 赵生仓, 曹蕾, 付珈宁, 唐志坚, 张军, 姜双应, 鲁晓晴, 梁国栋
CUI Shi-heng, FU Shi-hong, ZHAO Sheng-cang, CAO Lei, FU Jia-ning, TANG Zhi-jian, ZHANG Jun, JIANG Shuang-ying, LU Xiao-qing, LIANG Guo-dong
2013年青海省德令哈地区蚊虫及蚊媒病毒调查
Investigation of mosquitoes and arboviruses in Delingha area in Qinghai, 2013
疾病监测, 2016, 31(4): 346-350
Disease Surveillance, 2016, 31(4): 346-350
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.04.019

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收稿日期: 2015-12-18
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崔世恒, 付士红, 赵生仓, 曹蕾, 付珈宁, 唐志坚, 张军, 姜双应, 鲁晓晴, 梁国栋. 2013年青海省德令哈地区蚊虫及蚊媒病毒调查[J]. 疾病监测, 2016, 31(4): 346-350.
CUI Shi-heng, FU Shi-hong, ZHAO Sheng-cang, CAO Lei, FU Jia-ning, TANG Zhi-jian, ZHANG Jun, JIANG Shuang-ying, LU Xiao-qing, LIANG Guo-dong. Investigation of mosquitoes and arboviruses in Delingha area in Qinghai, 2013[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(4): 346-350.
2013年青海省德令哈地区蚊虫及蚊媒病毒调查
崔世恒1, 付士红2, 赵生仓3, 曹蕾2, 付珈宁2, 唐志坚3, 张军3, 姜双应3, 鲁晓晴1 , 梁国栋2     
1. 青岛大学公共卫生学院, 山东 青岛 266000;
2. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒性脑炎室传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
3. 青海省疾病预防控制中心, 青海 西宁 810007
收稿日期: 2015-12-18
基金项目: 国家自然科学基金重大项目(No.81290342)
作者简介: 崔世恒,男,山东省德州市人,硕士,主要从事虫媒病毒病监测工作;付士红,女,北京市人,副研究员,主要从事虫媒病毒检测工作;赵生仓,男,青海省西宁市人,主任技师,主要从事当地疾病预防控制工作
作者贡献: 崔世恒: 参与本研究蚊虫采集、实验室所有实验过程及后期文章撰写
付士红: 参与本研究的蚊虫采集、实验室实验过程
赵生仓: 参与本研究当地蚊虫采集工作
曹蕾、付珈宁: 参与本研究实验室部分实验过程
唐志坚、张军、姜双应: 参与本研究当地蚊虫采集工作
鲁晓晴、梁国栋: 负责指导本研究蚊虫采集、实验和文章撰写全过程
通信作者: 鲁晓晴,Tel:0532-83780073,Email:Luxq532@126.com;梁国栋,Tel:010-63510124,Email:gdliang@hotmail.com
摘要: 目的 调查青海省海西州德令哈地区蚊虫及蚊媒病毒的种类及分布。方法 在德令哈地区采集蚊虫标本, 蚊虫标本经实验室常规处理后使用C6/36、BHK-21和Vero细胞开展病毒分离及9种病毒特异性基因检测及分析。结果 2013年在德令哈地区共采集蚊虫6050只, 分别为黄背伊蚊和里海伊蚊, 其构成比分别为92.6%(5600/6050)和7.4%(450/6050)。所有蚊虫标本分为96批, 接种上述3种细胞, 这些蚊虫标本在BHK-21和Vero细胞上均未出现病变也未检测病毒基因阳性。但有32批蚊虫标本接种的C6/36细胞上清液和对应蚊虫标本研磨液中均检测到辽宁病毒(liaoningvirus, LNV), 其中黄背伊蚊27批, 里海伊蚊5批。病毒基因进化分析发现德令哈市分离的LNV与我国在新疆分离的LNV处在同一进化分支。结论 2013年青海省德令哈地区黄背伊蚊为优势蚊种, 黄背伊蚊和里海伊蚊标本中LNV感染率均较高, 为首次在当地发现LNV。
关键词: 青海省    德令哈    蚊虫    蚊媒病毒    辽宁病毒    
Investigation of mosquitoes and arboviruses in Delingha area in Qinghai, 2013
CUI Shi-heng1, FU Shi-hong2, ZHAO Sheng-cang3, CAO Lei2, FU Jia-ning2, TANG Zhi-jian3, ZHANG Jun3, JIANG Shuang-ying3, LU Xiao-qing1 , LIANG Guo-dong2     
1. Public Health Institute of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong, China;
2. State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
3. Qinghai Provincial Center for Disease Control and Prevention, Xining, Qinghai 810007, China
This study was supported by the fund from National Natural Science Foundation of China (No.81290342)
Corresponding author: Luxq532@126.comgdliang@hotmail.com
Abstract: Objective To investigate the species and distributions of mosquitoes and arboviruses in Delinha of Qinghai province. Methods Mosquito samples were collected from Delinha. The virus isolation from these samples was conducted by using C6/36, BHK-21 and Vero cells, and the isolates were identified with molecular biological methods. Results A total of 6050 mosquito samples were collected from in 2013, including 5600 Aedes flavidorsalis (92.6%) and 450 Aedes caspius (7.4%). All the mosquitoes were divided into batches to be inoculated with C6/36, BHK-21 and Vero cells for virus isolation. No pathogenic changes and virus genes were detected in all the mosquito samples inoculated with BHK-21 and Vero cells, but Liaoning virus(LNV)was detected in 32 batches of mosquitoes inoculated with C6/36 cells, i.e. supernate and grinding fluid, including 27 batches of Aedes flavidorsalis and 5 batches of Aedes caspius (15.6%). Phylogenetic analysis revealed that the LNV isolated from Delingha was in the same evolutionary branch with LNV isolated in Xinjiang. Conclusion Aedes flavidorsalis was predominant mosquito specie in Delingha in 2013. The LNV infection rates were high in both Aedes flavidorsalis and Aedes caspius. This was the first time to detect LNV in Delingha.
Key words: Qinghai    Delingha    Mosquitoes    Arbovirus    Liaoning virus    

已有研究显示，全世界蚊虫可以携带和传播300余种虫媒病毒，能够引起发热、脑炎、孕畜流产等人畜共患性疾病[1]。蚊媒病毒分布广，在全球大多部分都有分布，其中黄热病毒曾经是世界性的公共卫生问题[2]，给人类的健康和经济财产带来严重的损害。

我国存在流行性乙型脑炎和登革热等多种蚊媒病毒病[3]。近年来还在我国发现西尼罗病毒及其群体性病毒性脑炎的流行以及Tahyna病毒及其临床感染病例[4, 5]。

青海省位于我国西部，地处青藏高原东北部地区，平均海拔高，具有独特的高原性大陆气候。此前在青海省东北部地区(西宁、民和县等)和格尔木地区开展的虫媒病毒调查发现当地存在Tahyna病毒及其疾病流行以及呼肠孤病毒科病毒等。德令哈市位于青海省西北部地区，与青海省格尔木地区相邻，从未开展过蚊虫媒介和蚊媒虫媒病毒的调查研究。本研究首次在青海省德令哈地区开展蚊虫种类调查。

1 材料与方法 1.1 蚊虫标本的采集

用诱蚊诱卵器和功夫小帅牌诱蚊灯(武汉市吉星环保科技有限责任公司)进行蚊虫采集，采集时间选在20：00到次日07:00左右。采集地点选在灌木丛、小树林等。对采集的蚊虫标本在冰浴条件下进行形态学分类，每50只分为一管，编号登记，立即放入液氮中保存，干冰转移至实验室直至开始实验检测。

1.2 蚊虫标本实验室的处理

蚊虫标本每50只为一批，放入离心管，加入1 ml组织培养液，封闭后放入Tissuelyser振荡器(QIAGEN公司)，振荡2 min。离心管经4 ℃，12 000 r/min离心20 min，小心吸出离心上清液，冰浴保存。

1.3 组织培养细胞株

金黄色地鼠肾细胞 (BHK-21细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和白纹伊蚊卵细胞(C6/36细胞)均为中国疾病预防控制中心(CDC)病毒病预防控制所实验室保存。3种细胞培养液由本所实验室提供。其中C6/36细胞放置在28 ℃孵育箱中培养，BHK-21和Vero细胞放置在37 ℃、5%CO2孵育箱中培养。

1.4 病毒分离

取离心后的蚊虫研磨液各100 μl分别接种在BHK-21、Vero和C6/36细胞管，分别放入37 ℃和28 ℃孵育箱中培养。每隔12 h在显微镜下观察细胞状态，是否出现细胞病变(CPE)。当细胞出现CPE并达到细胞总体的75%的时候收取细胞，-20 ℃反复冻融3次，每批蚊虫上清液在3种细胞上盲传三代，无病变者丢弃。

1.5 病毒核酸提取及cDNA文库制备

使用QIAamp® Viral RNA试剂盒(QIAGEN公司)对蚊虫研磨液及细胞培养上清液进行RNA提取，实验步骤见试剂盒说明书。按照说明书使用ready-to-go试剂盒(GE Healthcare公司)对每份蚊虫标本研磨上清开展RNA反转录及cDNA文库制备，标本冻存于低温冰箱。

1.6 病毒基因检测

采用RT-PCR方法，使用GOTaqRGreen MIX PCR扩增试剂(Promega公司)，利用表 1所提供的引物对2013年青海省cDNA进行核酸扩增。获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳。阳性结果进行DNA序列测序。

表 1 本研究使用的引物 Table 1 Primers required for this study
分类 引物名称扩增区段(bp)引物序列(5′~3′)引用文献
属特异性引物 黄病毒属 FU1NS5(310)TAC CAC ATG ATG GGA AAG AGA GAG AA [6]
CFD2GTG TCC CAG CCG GCG GTG TCA TCA GC
布尼亚病毒属 BUPS(251)ATG ACT GAG TTG GAG TTT GAT GTC GC [6]
BDWTGT TCC TGT TGC CAG GAA AAT
甲病毒属M2WNSP1(434/310)YAG AGC DTT TTC GCA YST RGC HW [6]
cM3WACA TRA ANK GNG TNG TRT CRA ANC CDA YCC
M2W2TGY CCN VTG MDN WSY VCN GAR GAY CC
种特异性引物 GETE病毒NS3FNS3(810)CTT TCA GAG AGG ACA GAG CGT [6]
NS3RCTC TTC TGC CGT TAT CAA AGT TAG
辽宁病毒LNV10s110s(844)ATG AGT AAC GTG ACA GAG ATT CGT GC [7]
LNV10r1GGT CCC GGA CTT TCA CAG CTA CTT TC
LNV12s112s(435)CAC TGG CTC CGG CTG TAG TAA CAG
LNV12r1CTG TTC GGA TCA TCT GGA ATT TGA
OYA病毒OYA-11FNS(310)GGT TAA TAA CCA TTT TCC CCA [8]
OYA-2RACC TTC CTC ATG AAG TTG ACA
西藏环状病毒6-4-2F4s(848)CGA CAG ACC AAA AGA TAT [9]
6-4-2RTCA ACA CGT AAT CCA ATA
版纳病毒BAV-12-854-S12S(850)AAA TTG ATA GYG YTT GCG TAA GAC [6]
BAV-12-B2-RGTT CTA AAT TGG ATA CGG CGT GC
TYMO病毒CuTLV-FRDRP(400) TTT TCT GTG GCT ATC TAT TGG GC -(1)
CuTLV-RGTA CAA GGA ATC CGA TGC TAG G
注：(1)表示没有引用文献。TYMO病毒引物是笔者设计合成，经RT-PCR验证引物工作正常。
表选项
1.7 测序结果分析

用Clustal 1.8软件进行序列比对，用Mega 6软件进行系统进化分析，使用MegALign 6软件进行核酸与氨基酸的同源性分析。新测序的病毒信息提交GenBank。

2 结果 2.1 蚊虫标本

2013年7月在青海省德令哈市及市辖柯鲁柯镇进行蚊虫采集。德令哈市位于青海省的西北部(E96°15′~E98°15′，N36°55′~N38°22′)，海拔约3000 m，2个采集点相距约13 km。德令哈市采集点选在小树林，柯鲁柯镇采集点选在灌木丛。两地共采集蚊虫2种6050只，剔除雄蚊，经形态学鉴定，德令哈市共采集450只蚊虫，全部为里海伊蚊(Aedes caspius)，占总数7.4%(450/6050)。柯鲁柯镇共采集5600只，为黄背伊蚊(Aedes flavidorsalis)，占总数92.6%(5600/6050)。黄背伊蚊为优势蚊种。

2.2 病毒分离

采集的96批蚊虫标本研磨液分别接种到BHK-21、Vero和C6/36细胞上，每批标本连续观察5 d，与对照细胞相比，均未产生CPE。但是在32批蚊虫标本接种C6/36细胞的感染上清液中检测到辽宁病毒(Liaoning virus,LNV)基因，提示这批病毒可以在蚊虫细胞中扩增，但并不引起CPE。

2.3 病毒核酸检测

96批蚊虫研磨液制备的cDNA文库为基因扩增模板，经9种病毒(属)基因扩增引物的PCR检测，结果显示所有96批蚊虫研磨上清液的布尼亚病毒、黄病毒和甲病毒属相关基因扩增均为阴性，对其他6种病毒的相关基因(表 1)扩增也呈阴性。其中32批蚊虫上清中辽宁病毒基因扩增为阳性，同时在相应标本的C6/36细胞培养上清中也呈阳性。其中里海伊蚊中发现5株，蚊种病毒批携带率为55.6%(5/9)，占全部蚊虫的5.2%(5/96)；在黄背伊蚊中发现27株，蚊种病毒批携带率为31.0%(27/87)，占蚊虫的28.1%(27/96)。

2.4 序列测定和分析

对32批LNV基因检测阳性标本开展LNV第12基因节段的核酸序列扩增，并对其中4株病毒的第10片段基因扩增、测序。两种测序结果绘制系统进化树一致证明所有病毒分离物均为LNV。登录GenBank查询其他地区LNV的DNA序列(表 2)，与本实验结果进行对比分析(图 1)。结果显示这些病毒株基本分为两型。其中1997年辽宁NE97-31为Ⅰ型，其他毒株为Ⅱ型。并且该32株阳性病毒株处在同一进化分支，与辽宁省NE97-12[10]、新疆HM745537-B9、HM745559-J60[11]同源性最高，进化关系最近。与新疆HM745538-B10的同源性次之。

表 2 本研究所使用的辽宁病毒毒株序列信息 Table 2 Sequence information of Liaoning virus strains used in this study
片段(地区)病毒株GenBank号采集 环境时间宿主
第12片段
新疆HM745559-J60 HM745537-B9 HM745538-B10HM745559 HM745537 HM745538猪圈2006库蚊
辽宁NE97-12 NE97-31AY701350 AY317110猪圈1997背点伊蚊
第10片段
新疆HM745510-B9 HM745511-B10 HM745532-J60HM745510 HM745511 HM745532猪圈2006库蚊
辽宁NE97-12 NE97-31AY701348 AY317108猪圈1997背点伊蚊
青海M30-10-(1)草地2007凶小库蚊
注：(1)为未登录GenBank信息，系由本科室人员提供毒株序列。
表选项
图 1 新分离病毒第12片段基因系统发生树 Figure 1 Phylogenetic trees of the 12th segments of LNV isolates
图选项

同时用LNV第10片段引物基因扩增后，获得的核酸序列与其他地区LNV(表 2)序列对比分析(图 2)。结果发现这些病毒株明显分为两型，NE97-31为Ⅰ型，其他病毒株为Ⅱ型。本次新病毒株与新疆的3株病毒株同源性较高，进化关系最近。与NE97-12、M30-10株位于同一型的不同分支。

图 2 新分离病毒第10片段基因系统发生树 Figure 2 Phylogenetic trees of the 10th segments of LNV isolates
图选项
3 讨论

本研究在青海省德令哈地区2个蚊虫采集点共采集蚊虫1属2种6050只，其中黄背伊蚊为优势蚊种。但两地采集的蚊种和数量却有很大的差异，在德令哈市区采集的蚊虫全部为里海伊蚊；而在德令哈市柯鲁柯镇采集的蚊虫全部为黄背伊蚊。德令哈市区蚊虫采集生境为小树林，而柯鲁柯镇生境为灌木丛。由于在采集过程中两地采集环境(气温、天气、海拔)基本一致，两地蚊种不同的原因可能是因为蚊虫采集生境不同导致。里海伊蚊幼虫孳生在临时性和永久性积水中，而采集点选在池塘边的小树林，适宜里海伊蚊的生存；黄背伊蚊生存在干旱草原地带，与柯鲁柯镇周围荒漠地带相吻合。

本次研究发现德令哈地区的优势蚊种为黄背伊蚊，结合以往在青海省的蚊虫调查信息分析，格尔木市优势蚊种为屑皮伊蚊[12]，青海省东部地区的民和县优势蚊种为库蚊[13]，表明青海省蚊虫种类复杂多样，存在地域性差异。德令哈市与格尔木市相距仅300 km，但是两地优势蚊种却完全不同。蚊虫种类的不同可能与当地的生态环境有关。黄背伊蚊的主要生存环境是在干旱草原，而德令哈市地区干燥少雨、多荒漠地貌，为黄背伊蚊的生存提供了有利的条件。而屑皮伊蚊幼虫孳生在含盐分较高的积水里，所以屑皮伊蚊生存环境必然与高盐湖泊密切相关，在格尔木地区盐湖资源储存量巨大，这也是该地区屑皮伊蚊为优势蚊种的主要原因。民和县位于青海省东部地区，由于采集点选在人居附近的污水点和麦田中，适宜库蚊的生长，所以该地区的优势蚊种为库蚊。

在近年来，在青海省陆续发现了新的虫媒病毒。如2007年在民和县凶小库蚊中分离到LNV，同年在格尔木市屑皮伊蚊中分离到Tahyna病毒。本研究在德令哈地区的里海伊蚊和黄背伊蚊检测到32株LNV，但没有发现Tahyna病毒，可能与蚊虫种类有关。本次在里海伊蚊和黄背伊蚊中发现LNV，结合民和县凶小库蚊、新疆的库蚊中、辽宁的背点伊蚊中发现LNV，可知LNV可在不同蚊种中生存。

LNV病毒属于新分离的12节段的dsRNA病毒，在第八次国际病毒分类委员会报告上被分为Seadorna病毒属。LNV起初是在辽宁地区发现，然后在新疆、青海等地区再次分离。就目前分布来看，LNV主要分布在我国高纬度地区，可能与蚊虫的种类有一定的关系。据文献报道，LNV可导致小鼠感染后死亡[10]。虽还未有报道称可致人畜患病及死亡，但这表明LNV对人畜有潜在的威胁性。

从系统进化树上分析，LNV主要以NE97-12和NE97-31两型为主。本次发现的32株LNV都位于同一进化分支。从第12片段系统进化树上分析，本次32株病毒都为Ⅱ型LNV，与新疆3株和辽宁的NE97-12株核苷酸同源性非常高(>98.0%)，为推测LNV的进化方向提供了依据。而在第10片段系统进化树上，本研究的4株病毒与新疆的3株病毒处于Ⅱ型中同一进化分支，但与青海省民和县的M30-10处在不同的分支上。提示本次研究发现的毒株与民和县进化方向有可能不同。

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