疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (6): 459-462

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赵红庆, 高翔, 蒋毅
ZHAO Hong-qing, GAO Xiang, JIANG Yi
结核分枝杆菌中假设蛋白抗原表位的多态性研究
Polymorphism of human T cell epitopes of eight immune-related conserved hypothetical proteins in Mycobacterium tuberculosis
疾病监测, 2016, 31(6): 459-462
Disease Surveillance, 2016, 31(6): 459-462
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.06.005

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收稿日期：2015-12-28
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赵红庆, 高翔, 蒋毅. 结核分枝杆菌中假设蛋白抗原表位的多态性研究[J]. 疾病监测, 2016, 31(6): 459-462.
ZHAO Hong-qing, GAO Xiang, JIANG Yi. Polymorphism of human T cell epitopes of eight immune-related conserved hypothetical proteins in Mycobacterium tuberculosis[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(6): 459-462.
结核分枝杆菌中假设蛋白抗原表位的多态性研究
赵红庆1, 高翔2, 蒋毅1     
1. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
2. 北京市通州区疾病预防控制中心, 北京 101100
收稿日期: 2015-12-28
基金项目: 中国疾病预防控制中心青年科研基金(No.2015A102)
作者简介: 赵红庆,男,山东省邹平县人,助理研究员,主要从事传染病的防治与研究工作
通信作者: 蒋毅,Tel:010-58900779,Email:jiangyi@icdc.cn.
摘要: 目的 探究中国结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株中8个免疫相关的保守性假设蛋白Rv1158c、Rv1461、Rv1977、Rv2182c、Rv3207c、Rv3333c、Rv3378c和Rv3714c人T细胞表位的多态性。 方法 选取151株我国临床分离到的结核分枝杆菌菌株,对8种抗原基因进行PCR扩增,并运用Bioedit软件进行序列比对,比较其人T细胞表位的多态性。 结果 在151株菌株中,除了Rv1977外其余7个蛋白都表现保守,这与Comas等的研究结果一致。而Rv1977表现了一定的多态性,发生了3个异义突变和一个单碱基的缺失。在Rv1977中的3个T细胞抗原表位中有1个表位发生了变化。 结论 结核分枝杆菌中的8个与免疫相关的保守性假设蛋白的T细胞抗原表位中,大部分是保守的,只有Rv1977蛋白具有多态性,这种多态性可能反映了这个抗原参与了逃避宿主免疫的分化选择。
关键词： 结核分枝杆菌     保守假设蛋白     T细胞抗原表位     多态性    
Polymorphism of human T cell epitopes of eight immune-related conserved hypothetical proteins in Mycobacterium tuberculosis
ZHAO Hong-qing1, GAO Xiang2, JIANG Yi1     
1. State Key Laboratory for Communicable Disease Control and Prevention, Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
2. Tongzhou District Center for Disease Control and Prevention, Beijing 101100, China
Abstract: Objective To investigate the polymorphisms of human T epitopes of antigens Rv1158c, Rv1461, Rv1977, Rv2182c, Rv3207c, Rv-3333c, Rv3378c and Rv3714c in Mycobacterium (M.) tuberculosis isolated in China. Methods We selected 151 clinical isolates of M. tuberculosis for the amplification of gene sequences of the eight antigens. The sequence alignment was conducted with software Bioedit. Results Among the 151M. tuberculosis strains, all the proteins were conservative in T cell epitopes except Rv1977. There were three non-synonymous mutations and one frame shift mutation in Rv1977. The mutations and deletion in Rv1977 all affected one of three T cell epitopes. Conclusion Among 8 immune-related conserved hypotheticals proteins in M. tuberculosis, only Rv1977 showed polymorphism in T cell epitopes, indicating that the antigen might be involved in diversifying selection to evade host immunity.
Key words: Mycobacterium tuberculosis     Conserved hypotheticals protein     T cell epitope     Polymorphism    

结核病是严重的呼吸道传染病，被列为我国重大传染病之一。据世界卫生组织(WHO)年度报告，我国十多年来结核病一直是高负担国家之一，位居世界第二位[1]。2010年，Comas等[2]研究发现结核分枝杆菌的T细胞抗原表位具有较高的保守性，并据此推断结核分枝杆菌缺少抗原变异及免疫逃逸。以往研究发现结核分枝杆菌蛋白MPT64、PstS1、Rv3878、Rv2945c和 Rv0309中的T细胞抗原表位都存在不同程度的多态性[3-6]，这种多态性可能反映这个抗原参与逃避宿主免疫的分化选择[7-8]。

在免疫表位数据库(Immune Epitopes Database，IEDB)(www.immuneepitope.org)中，有8个保守的假设蛋白(Rv1158c、 Rv1461、 Rv1977、 Rv2182c、 Rv3207c、 Rv-3333c、 Rv3378c和Rv3714c)包含T细胞抗原表位[9]，表明其参与机体的细胞免疫反应。为了解中国结核分枝杆菌这8个蛋白的多态性，并探讨其对宿主T细胞和结核分枝杆菌相互作用的影响，笔者选取了中国151株临床结核分枝杆菌复合群分离株，扩增编码8个蛋白的基因，然后进行序列比对，分析其在T细胞抗原表位的多态性。

1 材料与方法 1.1 菌株来源、培养及DNA提取

从中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室保存的2346株国内结核分枝杆菌复合群临床分离株中挑选151株菌株。考虑到北京家族菌株在中国的优势性，挑选了约50%的北京家族菌株(77株，从1738株北京家族菌株中随机挑选)和非北京家族菌株(74株，从608株非北京家族菌株中挑选)，同时尽可能包括不同省份不同间隔区寡核苷酸分型方法(Spoligtyping)类型的菌株。这些菌株包括了所有已经在我国发现的Spoligtyping类型[10]。间隔区寡核苷酸分型方法根据之前的研究方法进行，并按照国际SpolDB数据库标准分为不同家族[11]。菌株的省份来源及间隔区寡核苷酸分型方法分型数据见表 1、2。

表 1 151株菌株的地区分布 Table 1 Area distribution of strains
省(自治区、直辖市)菌株数
安徽省10
陕西省15
北京市9
福建省28
甘肃省10
广西壮族自治区22
四川省1
河南省12
湖南省5
西藏自治区11
新疆维吾尔自治区9
吉林省10
浙江省9
表选项
表 2 151株菌的间隔区寡核苷酸分型 Table 2 Interval region oligo nucleotide typing of 151 strains
Spoligotypes型菌株数
Beijing77
T12
U24
MANU6
Haarlem5
EAI1
LAM2
S1
CAS4
H37Rv family1
new18
表选项

采用标准罗氏培养基培养菌株3~4周。用生理盐水从培养基的斜面上洗脱菌体，80 ℃孵育30 min灭活，离心收集菌体，用400 μl TE悬菌，于沸水中煮沸30 min，12 000 r/min 离心4 min，取上清即为DNA模板，-20 ℃保存备用。

1.2 目的基因引物、扩增及序列测定

引物(5′~3′)序列是根据H37Rv基因序列由DNAStar 7.0软件设计，引物的核酸序列见表 3。

表 3 8种特异抗原所用的引物及包含的T细胞抗原表位数 Table 3 Primers and T cell antigen epitopes of eight specific antigens
基因 引物序列(5′~3′)T细胞抗原表位数
Rv1158cCAA ACC TTT GCA CAC ACT CC GCA CTA CTT ACG GGC GGT AT1
Rv1461 GGC CTA CTT CCG AAT CAA CA CAC AGC CAT TGG TGA GAC AC1
Rv1977 CGC CGT ATT CTG AAG ACC GTG TTC GCA ATG CTA TGA G3
Rv2182c TTG ATC CAG CCT TTC AGT CC CGA GGG CAG CAT GAA ATC1
Rv3207c GCT ACC TCT TCA CGG CTG AG CTC GAG ACG TCC TGC TAC AAC1
Rv3333c GAT GGT CAT GTC CGA CAC C AAA CCA AGA CGA TCG GTT TCT1
Rv3378c GGC TAG CAA GCC TTT TTC AA ACG AAA CGC ATG GTA AAC CT1
Rv3714c TGA CGA TCC AGC CCA ACT CAG CAC GGT CTT GTC ATA CG1
表选项

目的基因扩增的PCR反应体系：模板DNA (500 pg)1 μl，10×PCR buffer 10 μl，引物 100 nmol/L，dNTP混合液 200 μmol/L，DNA Taq酶(TaKaRa) 0.5 U，ddH2O 加至20 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min，然后94 ℃变性45 s，62 ℃低温退火45 s，72 ℃延伸1 min，重复35个循环，最后72 ℃延伸10 min终止反应。

阳性对照所用模板为500 pg结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA；阴性对照不加入任何模板DNA，只有PCR试剂。PCR产物的有无及大小用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。所有的PCR实验都进行至少两次以确认实验的重复性。扩增产物由北京擎科生物技术有限公司进行双向测序和拼接。

1.3 8个蛋白基因中T细胞表位区的确定

检索免疫表位数据库(Immune Epitope Database，IEDB)，获得结核分枝杆菌中存在的T细胞抗原表位序列，再与H37Rv株的Rv1158c、Rv1461、Rv1977、Rv2182c、Rv3207c、Rv3333c、Rv3378c和Rv3714c基因序列进行比对，最终获得该基因中存在的人T细胞抗原表位信息。

1.4 数据分析

对PCR产物测序结果和NCBI下载获得的Rv1158c、 Rv1461、 Rv1977、 Rv2182c、 Rv3207c、 Rv3333c、 Rv3378c和Rv3714c基因序列进行核酸序列方向一致性调整，使用Clustal W 2.0软件进行alignment操作[12]；再根据H37Rv株Rv1158c、 Rv1461、 Rv1977、 Rv2182c、 Rv3207c、 Rv3333c、 Rv3378c及Rv3714c基因序列，截取所有测序菌株与之对应的基因全长序列；然后对获得的基因用Bioedit 7.1.3.0软件进行比对，得到T细胞抗原表位区的多态性。

2 结果 2.1 PCR扩增目的基因

以提取的DNA为模板，根据PCR实验程序，获得目的基因的PCR产物。151菌株都扩增出了其相应蛋白的PCR产物。电泳表明所扩增的PCR产物大小与理论大小基本一致。

2.2 8个蛋白基因中的T细胞抗原表位信息

经检索IEDB及与H37Rv基因序列进行比对，本研究在8个保守的假设蛋白中检索到的T细胞抗原表位信息见表 4。Rv1977包含有3个T细胞抗原表位，而其他7个蛋白各包含1个T细胞抗原表位。

表 4 8种抗原中T细胞抗原表位氨基酸变化情况 Table 4 Amino acid changes of T cell antigen epitopes in eight antigens
IEDB编号T细胞抗原表位碱基变化Rv标签
23064GVNAPIPGI无Rv1158c
28040IPRDEVRVM无Rv1461
2867ALRRLKGFDQILKLM SGMLR无
21306GMLRERQHRLLYL ASA无
23584HAVYRT MMMHLLRL ARSFGVLPVATG(M)-ATA(I); CCG(P)-TCG(S); 移码突变Rv1977
55199RPKVEGLEY无Rv2182c
50870QGGLAPVMMQQTFST无Rv3207c
70013VMRLYPVRLTTTMTR无Rv3333c
55192RPKPDYSAM无Rv3378c
60095SPKETWLRL无Rv3714c
注：以标准菌株H37Rv 中各抗原序列为参考序列；阴影表示氨基酸变化的位置。
表选项
2.3 8个保守假设蛋白基因中T细胞表位区变异

8个蛋白中除Rv1977外，其余7个蛋白在其T细胞抗原表位区都是保守的。151株结核分枝杆菌中有5株在Rv1977蛋白上具有多态性。包括3个异义突变和1个单碱基缺失。菌株GX06187、 HuN06099 和GS05113分别具有1个不同的异义突变；而FJ05406和FJ06051都在碱基的204位发生了同1个单碱基缺失(见表 4，表 5和图 1)。

表 5 151株结核分枝杆菌中蛋白Rv1977的变化情况 Table 5 Changes of Rv1977 in 151 M. tuberculosis strains
菌株号碱基变化氨基酸变化Spoligotypes
FJ05406204位缺失G移码突变EAI
FJ06051New
GX06187C397AH133NNew
HuN06099G444AM148IU
GS05113C487TP163SBeijing
注：以标准菌株H37Rv 中Rv1977蛋白序列为参考序列。
表选项
图 1 151株菌Rv1977抗原的序列比对结果 Figure 1 Sequence alignment results of Rv1977 in 151 M. tuberculosis strains
图选项
3 讨论

宿主-病原的协同进化关系以相互作用的物种之间的适应性变化为特征，表现在宿主免疫压力与病原体免疫逃逸之间的关系，称为“进化军备竞赛(evolutionary arms race)”[2]。对某些病毒、细菌及原生生物(HIV-1、丙型病毒性肝炎病毒、恶性疟原虫及脑膜炎球菌)的研究表明，为逃避宿主免疫，其病原体的抗原编码基因表现为高度可变，这是一种逃避人体免疫系统的多向性选择[7-8]。2010年，Comas等[2]研究发现结核分枝杆菌的T细胞抗原表位具有较高的保守性，并据此推断结核分枝杆菌缺少抗原变异及免疫逃逸。Rv1158c、 Rv1461、 Rv1977、 Rv2182c、 Rv3207c、 Rv3333c、 Rv3378c和Rv3714c都是结核基因组中的假设蛋白，并在宿主T细胞和结核分枝杆菌相互作用中发挥作用。笔者发现除Rv1977的编码基因外都表现保守，与Comas等[2]的研究结果一致。而Rv1977的编码基因表现了一定的多态性，发生了3个异义突变和1个单碱基缺失。Rv1977中的3个T细胞抗原表位中有1个表位发生了变化。而且，Rv1977编码基因的单碱基缺失同时发生在2个菌株上，说明这个突变不是自发突变。Rv1977抗原表位的改变反映了正在进行的免疫逃逸。尚需进一步研究以确认此改变是由于免疫压力、其他的选择压力还是随机的基因漂移所致。

根据间隔区寡核苷酸分型方法分型结果，在Rv1977有突变的菌株包括1株EAI菌株(FJ05406)，2株New菌株(FJ06051和GX06187)，1株U家族菌株(HuN06099)和1株北京家族菌株(GS05113)。FJ05406和FJ06051在同一位置发生了单碱基缺失。从结果可以看出，Rv1977 T细胞抗原表位变化菌株的基因分型没有关系，可能是由于基因分型都是建立在非编码区多态性的基础上而T细胞抗原表位位于蛋白的编码区。

目前Rv1977的功能不清，不能确定是否氨基酸的改变造成蛋白功能的改变，但可以推测2株发生了单碱基突变的菌株在结核菌与宿主的T细胞相互作用方面不同，也可能代表了一类特殊的结核分枝杆菌，还需进一步的研究。

综上所述，结核分枝杆菌中的8株与免疫相关的保守性假设蛋白中，大部分是保守的，只有Rv1977蛋白具有多态性，这种多态性可能反映了这个抗原参与了逃避宿主免疫的分化选择。

参考文献
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