李斯特菌(Listeria)是兼性细胞内生长的革兰阳性菌。最常见的李斯特菌有6种，即单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，L. monocytogenes)、伊氏李斯特菌(L. ivanovii)、英诺克李斯特菌(L. innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)和与它们关系较远的格氏李斯特菌(L. grayi)，其中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌具有致病性，伊氏李斯特菌仅引起动物发病，在极少数情况下能够引起人类发病。单增李斯特菌致病能力较强，是一种重要的人兽共患食源性致病菌^[1]，单增李斯特菌可以引起婴儿、孕妇、老年人以及免疫功能不全者发病，其主要临床表现为败血症、脑炎、脑膜炎、死产等^[2-3]，李斯特菌病的临床病死率较高，可达20%~30%^[4]。

李斯特菌广泛存在于肉类、水产、牛奶等产品中，能在高盐、低温、干燥、以及pH 4.0~9.5等多种较严酷的条件下生存繁殖^[5-6]。该菌主要通过食源性传播。随着肉制品、奶制品等消费的增多，越来越多的李斯特菌病在各国暴发或者流行，这也引起了世界各国对该菌的高度关注，将其列为重点监测的食源性致病菌。尽管目前已有多种分子生物学方法和免疫学方法被用于检测李斯特菌的存在，但传统的分离培养方法仍是判断李斯特菌存在与否的“金标准”。传统培养方法需要经过在液体培养基中进行两步增菌，以及在固体选择培养基上的选择鉴别方可得到李斯特菌的纯培养，用于后续的实验研究。本研究对李斯特菌分离所使用的方法，李斯特菌选择性培养基的原理、分离效果以及现有培养基的不足之处进行了阐述。

目前国际上公认的从样品中分离李斯特菌的方法主要包括：美国食品药品监督管理局(FDA)的方法，美国分析化学家协会(AOAC)的方法，欧洲标准委员会(EN ISO)的方法，美国农业部食品安全检验署(USDA-FSIS)的方法^[7]，以及北欧食品分析委员会(NMKL)的方法^[8]。以上方法大同小异，都是经过两次(或一次)增菌后，将增菌液涂到选择性固体培养基上培养，观察是否有典型的单增李斯特菌或其他李斯特菌菌落存在。

不同方法选择的增菌液与固体培养基不同，培养基中各种添加剂及其作用详见表 1。EN ISO方法选择的一次增菌液为Half-fraser[(30±1) ℃，增菌(24±3)h]，二次增菌液为Fraser [(37±1)℃，增菌(48±3)h]，Half-fraser与Fraser中具有抑菌作用的物质都是氯化锂、盐酸吖啶黄以及萘啶酮酸，只不过Half-fraser中添加剂的浓度是Fraser中的一半。EN ISO方法推荐的固体选择培养基为ALOA平板或者其他固体选择培养基(Oxford或者PALCAM)，ALOA平板中含的选择性物质有氯化锂、萘啶酮酸、头孢他啶、多粘菌素B和两性霉素B，这些添加剂可以有效地抑制革兰阴性菌和真菌的生长^[9-10]。

USDA-FSIS的方法选用的一次增菌液为UVM，二次增菌液为MOPS-BLEB或者Fraser^[11]，UVM中含有萘啶酮酸和吖啶黄，MOPS为一种pH缓冲剂，一些文献中提到用MOPS作为pH缓冲剂时比用磷酸氢盐作为缓冲剂的增菌液稳定性及重现性更好^[12]。并且当磷酸氢盐浓度较高时，一些李斯特菌容易产生噬菌体，可以使细菌溶解或者自我溶解^[13]，BLEB中含有的选择性物质为盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和环己酰亚胺。最后将二次增菌液涂于MOX平板上，MOX平板是在Oxford基础上进行改良，改变了营养基础和一些添加剂，使其快速溶解、质量稳定、环保，其中含有氯化锂、粘菌素、拉氧头孢和磷霉素等选择性物质。

NMKL的方法与ISO方法相似，选择的一次增菌液为Half-fraser(增菌24 h)，二次增菌液为Fraser(增菌48 h)，然后将一次和二次增菌液分别涂于ALOA平板或者其他与ALOA相似的固体选择性培养基，可疑菌落还需要进行生化鉴定^[8]。

FDA的方法与其他方法有所不同，首先将样品加入到含有磷酸二氢盐和丙酮酸的胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)中(此时的培养基中不含有选择剂)，在30 ℃条件下预增菌4 h，其中丙酮酸对损伤的李斯特菌具有恢复作用，然后加入选择剂盐酸吖啶黄(10 mg/L)、萘啶酮酸(40 mg/L)、环己酰亚胺(50 mg/L)，在30 ℃条件下继续培养直到48 h，根据FDA方法的规定分别将24 h和48 h的增菌液涂于MOX平板或者加入铁离子的LPM平板上进行菌落分离^[11]，LPM平板中有氯化锂、苯乙醇、拉氧头孢。

除上述国际公认的方法外，我国制定了针对李斯特菌检测的国标法(GB 4789.302010)。国标法中一次增菌液为LB1，二次增菌液为LB2，它们的添加剂为萘啶酮酸和吖啶黄，然后将二次增菌液涂于PALCAM琼脂平板进行菌落分离，PALCAM琼脂平板中包含的物质有：多粘菌素、吖啶黄、氯化锂、头孢他啶、七叶灵、甘露糖。

上述方法中提到的一些选择性固体培养基(如Oxford、PALCAM、MOX、LPM等)都是一些比较传统的选择性培养基，均是利用葡萄糖苷酶水解七叶灵产生葡萄糖和七叶苷原，而七叶苷原与铁离子结合呈现棕黑色，所以李斯特菌在这些培养基上都会呈现黑灰色^[14]。而Harlequink Listeria培养基是一种显色培养基，但与新型显色培养基原理不同，它利用李斯特菌中的葡萄糖苷酶分解环己烯-七叶苷-β-D吡喃葡萄糖苷产生黑色菌落^{[4, 15]}。现在发展了很多新型的选择性显色培养基例如BCM、RapidL. mono、LIMONO-Ident-Agar、ALOA、CHROMagar Listeria、OCLA、Brilliance Listeriaagar等，其中BCM培养基是利用致病性李斯特菌中的磷酸酰肌醇-磷脂酶C(PI-PLC)分解5-溴-4-氯-3-吲哚酚-肌醇-1-磷酸(X-IP)产生蓝绿色菌落，而非致病菌不会产生PI-PLC，所以它们的菌落为白色，RapidL. mono培养基显色原理与BCM培养基相同，但该平板含有苯酚作为pH指示剂，所以它的本底颜色为棕红色，伊氏李斯特菌可以利用Rapid’L. mono培养基中的木糖产酸，因此在该平板上伊氏李斯特菌的菌落为蓝绿色周围有黄色环，这样可以与单增李斯特菌进行很好的区分^[4]。LIMONO-Ident-Agar培养基也是利用PI-PLC分解X-IP产生蓝绿色菌落但其周围还会产生白色沉淀，这种沉淀环的形成是由于单增李斯特菌对该培养基中一些营养物的利用及磷脂混合物的添加所导致。ALOA、CHROMagar Listeria、OCLA、Brilliance Listeria Agar培养基的原理相同，利用β-D-葡萄糖苷酶分解显色物质5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-吡喃葡萄糖苷使菌落呈现蓝绿色，还利用PC-PLC 和PI-PLC分解L-α-磷脂酰肌醇产生不溶于水的脂肪酸，使菌落周围形成了白色沉淀，在这种培养基上单增李斯特菌和伊氏李斯特菌呈现蓝绿色菌落周围有白色沉淀环，非致病性李斯特菌的菌落呈现蓝绿色但没有白色沉淀环^{[4, 16-17]}。

还有一些新发展的但没有商品化的新型选择性培养基，例如左氟沙星卵磷脂培养基(LL培养基)。LL培养基中含有大豆卵磷脂，单增李斯特菌会利用PI-PLC与PC-PLC的作用水解大豆卵磷脂产生晕环，左氧氟沙星会抑制除了李斯特菌以外的其他菌生长，在LL培养基上，单增李斯特菌与伊氏李斯特菌的菌落为白色有晕环，而其他李斯特菌仅为白色菌落^[18]。另外，ACTERO李斯特增菌液是一种新型的未普遍使用的，专门为环境样本中李斯特菌的分离而研发的一步法增菌液^[19]，对于环境样本它可以有效代替两步法增菌。

不同培养基对李斯特菌的选择效果不同，Harlequink Listeria培养基中反应产生的黑色色素会固定在菌落周边而不像PALCAM等传统的选择培养基产生的色素会扩散，如此一来对可疑菌落的筛选更加简单，Smith等^[15]发现Harlequink Listeria培养基比Oxford培养基中多发现34%的阳性菌落。有人把ALOA平板与传统的Oxford平板和PALCAM平板进行了比较，发现对自然污染的奶制品和肉制品检验时，ALOA平板能比Oxford平板多发现4.3%的阳性样品，当样品中同时含有英诺克李斯特菌和单增李斯特菌时，在ALOA平板上单增李斯特菌菌落周围有白色沉淀而英诺克李斯特菌的菌落周围没有白色沉淀环，从而将二者区分开来，Oxford 和PALCAM平板上单增李斯特菌与英诺克李斯特菌菌落完全相同无法区分，因此ALOA平板的分离效果明显优于Oxford和PALCAM平板^[20]。RapidL.mono平板与ALOA平板的分离效果相当^[21]。李斯特菌血平板(LMBA)的分离效果也很好，但是鉴于血液来源批次与批次间不同，所以不推荐大规模使用。Hechelmann发现对相同样品进行分离时，BCM对单增的检出率为4.8%而PALCAM对单增的检出率为3.2%^[4]。有人对BBL CHROMagar Listeria平板与Oxford、MOX、PALCAM琼脂平板比较后发现，CHROMagar Listeria琼脂平板对单增李斯特菌的确认率为100%，而PALCAM等传统培养基对单增李斯特菌的确认率仅为50%^[22]，传统的PALCAM琼脂平板在筛选李斯特菌时灵敏度和特异度都要低于CHROMagar Listeria显色平板，这是由于CHROMagar Listeria显色平板中含有大豆卵磷脂，单增李斯特菌中的卵磷脂酶可以分解大豆卵磷脂，使菌落周围呈现透明环，很容易将单增李斯特菌与非致病性的李斯特菌区分开来，而PALCAM平板上单增李斯特菌菌落形态与其他的李斯特菌菌落形态完全相同，在随机挑选菌落进行后续鉴定的过程中，容易将单增李斯特菌遗漏。Park等^[18]对MOX，Brilliance Listeria Agar，CHROMagar Listeria Agar，LL平板进行比较，Brilliance Listeria Agar的准确率、灵敏度与特异度均高于CHROMagar Listeria，CHROMagar Listeria各项指标均高于MOX，而LL培养基的各项指标与Brilliance Listeria agar培养基相当。综合来看，新型的显色培养基对李斯特菌尤其单增李斯特菌的选择鉴别效果明显优于传统的选择培养基，而Brilliance Listeria培养基的效果相比较更好一些。

在复杂的微生物菌群中分离出目标菌是很有挑战的，选择培养基中加入的选择性物质是为了抑制除李斯特菌以外的细菌的生长，但是抑制其他细菌的同时也会对李斯特菌产生抑制。MacDonald等^[23]研究发现在TSB中5株单增李斯特菌的平均代时为42.9 min，5株英诺克李斯特菌的平均代时为43 min，而在加有添加剂的选择培养基中5株单增李斯特菌的平均增代时间为71.9 min，5株英诺克李斯特菌的平均增代时间为54.8 min，这些数据显示添加剂对李斯特菌具有抑制作用，并且对单增李斯特菌的抑制作用大于对英诺克李斯特菌的抑制作用。Liamkaew等^[24]发现按照ISO的方法进行分离鉴定，将固体选择性培养基的添加剂减少到标准量的25%时，很明显的提高了培养基对李斯特菌属细菌的检测能力，而特异度没有明显下降。在杂菌抑制方面，MOX培养基中的添加剂浓度降低到标准浓度的50%时，E.coli、S.anatum、E.faecalis全部被抑制，而S.aureus有13%被抑制，当使用标准浓度的添加剂时，MOX对S.aureus的抑制也仅达到21%。当OCLA和PALCAM培养基的添加剂浓度为50%标准浓度时，就可以完全抑制大肠埃希菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌的生长。他们还发现当添加剂浓度为标准浓度的25%时，在OCLA、PALCAM、MOX上的检测灵敏度均为100%，因此认为当选择性培养基的添加剂浓度过高时会损伤或者抑制一些李斯特菌^[24]。朱敏等^[25]通过测定不同浓度的吖啶黄、萘啶酮酸、亚碲酸钾对单增李斯特菌和大肠埃希菌、蜡样芽胞杆菌的生长的影响，选择出最适的添加剂浓度(低于国标法)，制成改良的李斯特菌增菌液，发现与国标法相比单增李斯特菌的检出率明显提高。Hegde等^[22]发现不同种的李斯特菌对选择培养基反应不同，当培养基中添加剂浓度为标准浓度的10%~100%时，单增李斯特菌和英诺克李斯特菌的生长速度始终快于伊氏李斯特菌，并且在电子显微镜下观察发现培养基上伊氏李斯特菌的菌落也明显比单增李斯特菌和英诺克李斯特菌的菌落小，提示伊氏李斯特菌对很多添加剂都很敏感。伊氏李斯特菌的分离率明显低于单增李斯特菌的分离率，这一现象可能是由于环境中存在的伊氏李斯特菌本来就很少，也可能是伊氏李斯特菌仅存在于某些特定的宿主中，或者还可能是在分离过程中由于添加剂的作用抑制了伊氏李斯特菌的生长。

在病原菌分离过程中，杂菌或者非目标菌的竞争生长会严重影响目标菌的分离。在单增李斯特菌增菌的过程中，无害李斯特菌的过度生长经常会掩盖单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的存在^[26-27]，导致假阴性结果。前文提到的添加剂对致病性李斯特菌的抑制作用也有可能造成假阴性结果，因此认为改变添加剂的种类或者降低添加剂浓度也许可以降低检测的假阴性率。另外，目前的显色培养基(如Brilliance Listeria Agar、ALOA等)只可以区分致病性李斯特菌与非致病性李斯特菌两个大组，不能进一步将致病性李斯特菌区分为单增李斯特菌和伊氏李斯特菌，也不能将非致病李斯特菌区分为无害李斯特菌、西尔李斯特菌、威尔李斯特菌等。这也可能是目前伊氏李斯特菌、西尔李斯特菌等较少从标本中分离到的原因之一。因此，可以根据不同种的李斯特菌对营养物质利用的不同在固体选择培养基中加入特异性的底物及指示剂，发展具有更好鉴别作用的培养基。

为了更好地了解李斯特菌在标本中的实际污染状况，特别是提高致病性李斯特菌在食品及临床标本中的检出率，迫切需要发展新型的李斯特菌增菌液和选择及鉴别培养基，可以有效抑制杂菌和无害李斯特菌的生长，同时能够有效区分李斯特菌的各个种，从而提高李斯特菌的分离率，减少检测结果的假阴性率，为食源性单增李斯特菌的病原学检测，以及李斯特菌病例的监测提供有力的技术支持，从而为预防和控制李斯特菌病提供基础。