疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (7): 540-545

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李勇, 王春, 唐海丰, 王爱敏, 黄峥, 石维敏, 胡雪明, 顾宝柯, 曾玫, 史贤明, 阚飙, 许学斌
LI Yong, WANG Chun, TANG Hai-feng, WANG Ai-min, HUANG Zheng, SHI Wei-min, HU Xue-ming, GU Bao-ke, ZENG Mei, SHI Xian-ming, KAN Biao, XU Xue-bin
上海市蒙得维的亚沙门菌流行特征研究
Molecular epidemiology and drug susceptibility of Salmonella Montevideo in Shanghai
疾病监测, 2016, 31(7): 540-545
Disease Surveillance, 2016, 31(7): 540-545
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.07.004

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收稿日期：2015-11-19
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李勇, 王春, 唐海丰, 王爱敏, 黄峥, 石维敏, 胡雪明, 顾宝柯, 曾玫, 史贤明, 阚飙, 许学斌. 上海市蒙得维的亚沙门菌流行特征研究[J]. 疾病监测, 2016, 31(7): 540-545.
LI Yong, WANG Chun, TANG Hai-feng, WANG Ai-min, HUANG Zheng, SHI Wei-min, HU Xue-ming, GU Bao-ke, ZENG Mei, SHI Xian-ming, KAN Biao, XU Xue-bin. Molecular epidemiology and drug susceptibility of Salmonella Montevideo in Shanghai[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(7): 540-545.
上海市蒙得维的亚沙门菌流行特征研究
李勇1, 王春2, 唐海丰1, 王爱敏3, 黄峥4, 石维敏5, 胡雪明6, 顾宝柯7, 曾玫3, 史贤明8, 阚飙9, 许学斌7     
1. 上海市普陀区疾病预防控制中心, 上海 200333;
2. 上海交通大学儿童医院, 上海 200040;
3. 上海复旦大学附属儿科医院, 上海 201102;
4. 上海市长宁区疾病预防控制中心, 上海 200051;
5. 上海科玛嘉微生物技术中心, 上海 200434;
6. 上海市静安区疾病预防控制中心, 上海 200041;
7. 上海市疾病预防控制中心, 上海 200336;
8. 上海交通大学农业与生物学院, 上海 200240;
9. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 102206
收稿日期: 2015-11-19
基金项目: 国家863项目（No.2012AA101601-4）；国家科技重大专项（No.2012ZX10004215-003，2012ZX10004201）；中美新发和再发传染病合作项目（No.1U2GGH000961-01）；上海市自然科学基金（No.13ZR1404100）
作者简介: 李勇,男,四川省中江县人,主管技师,主要从事食源性病原监测和溯源工作;王春,女,上海市人,主管技师,主要从事临床微生物检测工作
作者贡献: 李勇和王春同为第一作者
通信作者: 曾玫,Tel:021-64931132,Email:zengmeigao@aliyun.com;许学斌,Tel:021-62758710,Email:xuxuebin@scdc.sh.cn.
摘要: 目的 研究蒙得维的亚沙门菌的耐药及分子流行病学特征。方法 基于上海市针对人群和食源、环境沙门菌的监测基线，分析蒙得维的亚腹泻和食源环境株的耐药表型和分子型特征。结果 蒙得维的亚在本地区的人源和食源沙门菌型数据库中列第24位（32株）和32位（13株）。经实验室确诊的28例蒙得维的亚病例均符合食源性感染特征，易感人群为5岁以下儿童和20～60岁男性，城郊地区高发。人源和食源株均发现对三代头孢（头孢他啶）耐药株，近5年中食源株的多重耐药（MDR）明显增多，28.1%的人源株对环丙沙星处于耐药临界值，来自境外动物制品的蒙得维的亚菌株对抗生素多数敏感。32株人源和13株食源株的分型聚类提示存在优势克隆簇，包括3起经回顾性鉴别诊断的蒙得维的亚的成人暴发，其中2起为多重耐药（MDR-ACSSuT）的克隆暴发。MDR-ACSSuT的人源流行株与甲鱼株之间存在高度的遗传同源性，与境外输入菌株间的耐药和分子型特征差异较大，2个不同克隆簇之间存在遗传进化关系。结论 蒙得维的亚尚未在本地区成为优势种型，但其已通过贸易等方式不断输入国内，逐渐定殖于沿海地区的甲鱼养殖产业链和人群的消费食物链中，最终进化成稳定的MDR和非MDR克隆容易形成分散而隐蔽的食源性暴发。
关键词： 蒙得维的亚沙门菌     分子分型     多重耐药     食源性暴发    
Molecular epidemiology and drug susceptibility of Salmonella Montevideo in Shanghai
LI Yong1, WANG Chun2, TANG Hai-feng1, WANG Ai-min3, HUANG Zheng4, SHI Wei-min5, HU Xue-ming6, GU Bao-ke7, ZENG Mei3, SHI Xian-ming8, KAN Biao9, XU Xue-bin7     
1. Putuo District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200333, China;
2. Children Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China;
3. Pediatric Hospital Affiliated Fudan University, Shanghai 201102, China;
4. Changning District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200051, China;
5. Shanghai Kemajia Microbiology Technical Center, Shanghai 200434, China;
6. Jing'an District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200041, China;
7. Shanghai Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China;
8. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China;
9. Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract: Objective To study the molecular epidemiological characteristics and antibiotic susceptibility of Salmonella enterica serovar Montevideo (S. Montevideo). Methods The analysis was conducted by using the surveillance data in Shanghai Collect and analyze Salmonella surveillance database in Shanghai. Results S. Montevideo ranked 24th (32 isolates) among all Salmonella serotypes from human and 32nd(13 isolates) from food source in Shanghai, respectively. Twenty eight foodborne infections of S. Montevideo were laboratory confirmed among diarrheal cases. Children under 5 years old and male adults aged 20-60 years were more susceptible, and the incidence in suburb area was high. Antibiotic susceptibility test showed that both foodborne and human isolates were resistant to the third-generation cephalosporin (Ceftazidime). Moreover, multi drug resistant (MDR) foodborne isolates increased significantly in recent five years, and 28.1% of human sourced S. Montevideo isolates were intermediate to ciprofloxacin. However, the isolates from foreign animal products were mostly sensitive to antibiotics. PFGE indicated that prevalent clones of S. Montevideo strains existed in Shanghai, including MDR-ACSSuT which caused two of three outbreaks in adults. MDR-ACSSuT isolates from human and turtles shared high homology, but quite different from foreign isolates. Phylogenetic relationship existed between the two different clone clusters. Conclusion S. Montevideo is not predominant in Shanghai, but it has been transmitted to China through trade and gradually colonized in coastal turtle cultivation and food chain. The MDR clones and non-MDR strains might cause sporadic outbreaks, which are difficult to detect.
Key words: Salmonella enterica serovar Montevideo     Molecular typing     Multi drug resistance     Foodborne disease outbreak    

2015年，沙门菌相关的疾病负担已在美国位居食源性疾病首位。2013年，美国疾病预防控制中心(CDC)发布的抗生素耐药报告也将非伤寒沙门菌列为严重威胁的行列[1-3]。蒙得维的亚沙门菌长期肆虐于南美地区，是前10位的食源性沙门菌暴发菌型，一直未见耐药株报道。笔者通过文献评估认为，蒙得维的亚在全球范围存在区域性高水平流行和动物兽医的高暴露特征，有逐渐向亚洲地区扩散输入的风险[4]。作为国家的传染病识别网络实验室之一，上海市公共卫生和临床机构合作开展基于实验室诊断的沙门菌的网络化和多源化的监测，而凭借该数据库研究蒙得维的亚在国内的流行基线与疾病生态学关联，通过比较不同来源的蒙得维的亚菌株的耐药表型及分子型特征，为国内外公共卫生机构、农牧养殖业、农业与食品安全监管机构提供防控和循证依据[5]。

1 材料与方法 1.1 研究菌株

上海沙门菌型数据库始于2005年，基于食源性感染性网络实验室覆盖的9个公共卫生机构和23家哨点医院的全人群和食品、环境的主动监测，截至2014年人源沙门菌共计8222株，涵盖93种血清型。3165株食源性沙门菌来自大型超市、农贸市场和环境，包括分割猪肉、鸡肉、牛肉、定型包装食品、海水介壳、海水鱼、淡水介壳、淡水鱼、禽粪、畜粪、甲鱼、牛蛙、蛋和蛋制品、蔬菜、熟食、黄浦江水、污水、饲料，涵盖76种血清型。经网络参比实验室复核鉴定蒙得维的亚[6,7:g,m,s:-]人源株32株，食源株13株。大肠埃希菌ATCC25922和布伦登卢普沙门菌H9812分别是药敏试验和PFGE标准分子质量的质控菌株。

1.2 培养基和仪器

胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、改良亚硒酸盐磺绿增菌液(SBG)、罗伯特增菌液(RVS)、木糖赖氨酸胆酸盐琼脂平板(XLD)、沙门菌显色琼脂平板(CAS)、水解酪蛋白琼脂平板(MH)、沙门菌O和H相位鉴定与诱导琼脂平板、肠道双支糖综合鉴别管和系列生化鉴定管(上海科玛嘉微生物技术有限公司)、沙门菌分型血清145种 (SSI，丹麦)、限制性内切酶XbaⅠ(TaKaRa，日本)；低熔点琼脂糖(SeaKem Gold，Cambraex Bio Rockland，美国)。以上试剂和血清等均避光置10 ℃以下保存，有效期内使用。VitekAM-60自动生化鉴定仪和菌液比浊仪(生物梅里埃，法国)；脉冲凝胶电泳仪(CHEF mapper system)和凝胶成像系统(GEL Doc2000，Bio-Rad，美国)。

1.3 抗生素敏感性试验

药敏分配器和抗生素纸片[四环素(TET)、亚胺培南(IMP)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、氨苄西林(AMP)、复方新诺明(SXT)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(C)、氧氟沙星(OFX)、萘啶酸(NA)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、甲氧苄氨嘧啶(W)、头孢他啶(CAZ)、庆大霉素(CN)、磺胺异噁唑(S3)、链霉素(S)](Oxoid，英国)；参照2012年CLSI(M-100)判别敏感(S)、中介(I)、耐药(R)。ACSSuT：对AMP、C、S、S3、TET的多重耐药(MDR)型[6]。

1.4 脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)

按照PulseNet China技术方案规定的非伤寒沙门菌PFGE- XbaⅠ标准方法，完成45株蒙得维的亚沙门菌凝胶电泳并使用BioNumerics 6.0软件进行聚类分析。

2 结果 2.1 上海地区人源蒙得维的亚沙门菌的基本流行病学特征

蒙得维的亚沙门菌在监测到的菌株库中位居24位，属不常见血清型，32株菌株来自28例腹泻病例，其基本流行特征为：(1)时间分布：20062008年5例，20102014年均4例以上，呈上升趋势。(2)人群分布：男性(22例)显著多于女性(6例)，最小病例4月龄，最大77岁；<5岁以下8例(其中4例出现2次以上的感染)，20～60岁15例，61～80岁5例。(3)地区分布：城郊病例(14例)显著多于市区(6例)，无血流和脑(脊液)感染病例。2010年金山区中心医院(2例)、2013年浦东医院(3例)和闵行区中心医院(2例)经实验室诊断结合流行病学调查确认均属家庭(或外出)就餐史的聚集病例，未追溯到传染源。所有临床症状均以腹泻、呕吐、脱水、发热为主，无血便，见图 1和表 1。

图 1 人源和食源蒙得维的亚菌株的年度分布 Figure 1 Annual distribution of S. Montevideo isolates from diarrheal patients and food sources
图选项
表 1 28例蒙得维的亚病例的年龄组和性别、就诊医院分布 Table 1 Gender,age and hospital distributions of 28 S. Montevideo infection cases
蒙得维的亚病例实验室诊断
例数构成比(%)
性别
男性2278.6
女性621.4
年龄组(岁)
>14(2(1))14.3
1~4(2(1))14.3
5~00
21~725.0
41~828.6
61~80517.8
就诊医院
市区621.4
城郊1450.0
儿童专科828.6
 注：(1)：二次感染病例数。
表选项
2.2 上海地区食源蒙得维的亚沙门菌的基本特征

蒙得维的亚位居32位，亦属不常见血清型。13株蒙得维的亚来自甲鱼(4株)和牛蛙(2株)、进口动物饲料(3株)、海水产品(带鱼和花蛤各1株)、淡水贝壳(螺蛳1株)和禽肉制品(鸭肉1株)。

2.3 耐药特征

人源株的耐药谱与食源株耐药谱接近，食源株多重耐药在近5年明显增多，导致抗生素耐药谱有逐年增高趋势。人源和食源株均发现对三代头孢(CAZ、CTX)耐药和中度敏感株，但对四代头孢(FEP)和IPM敏感；对喹诺酮类药物的结果显示人源菌株的环丙沙星有28.1%处于耐药临界值；耐6~11种药物的MDR人源和食源株分别为34.4%和46.2%，食源性略高于人源株；多重耐药株：MDR-ASSuT和ACSSuT虽均在人源和食源株中发现，但人源的ACSSuT耐药数量明显多于食源株，见表 2。

表 2 蒙得维的亚人源与食源株的抗生素耐药谱 Table 2 Antibiotic resistance spectrum of S. Montevideo isolates from human and food sources
抗生素人源(n=32) 食源(n=13)
R I S R I S
%菌株数%菌株数%菌株数%菌株数%菌株数%菌株数
TET40.1130.0059.91930.840.0069.29
IPM0.000.00100.0320.000.00100.013
AMC28.199.4362.52038.550.0061.58
AMP34.4110.0065.62146.260.0053.87
SXT25.080.0075.02446.260.0053.87
CIP0.0028.1971.9230.007.7192.312
CIP(1)28.190.0071.9237.710.0092.312
C25.080.0075.02415.420.0084.611
OFX0.000.00100.0320.000.00100.013
NA43.81418.8637.41223.137.7169.29
FEP0.000.00100.0320.000.00100.013
CTX0.0015.6584.4270.0015.4284.611
W25.080.0075.02438.550.0061.58
CAZ3.113.1193.83015.4215.4269.29
CN18.860.0081.2267.710.0092.37
S368.82213.4418.8661.587.7130.84
S71.92321.976.2269.2915.4215.42
ASSuT(2)6.22 15.42
ACSSuT25.08 15.42
MDR-6~11(3)34.411 46.26
 注：(1)参照CLSI2012伤寒、副伤寒判断标准。(2)对AMP、S、S3、TET的多重耐药株。(3)耐6~11种抗生素的多重耐药株。
表选项
2.4 分子分型特征

45株蒙得维的亚(32株人源和13株食源)经XbaⅠ酶切成30种带型，树状聚类图显示菌株间DNA相似度在68.1%~96.8%之间，按照相似指数分：<80%者为克隆簇A，>80%者为克隆簇B。克隆簇A均为抗生素敏感株，包含4株腹泻和3株境外输入株，低年龄组病例(包括1例二次感染病例)株的遗传相似度高，2例成年人散发菌株和越南、澳大利亚的饲料株间有较高同源性；克隆簇B包含24株腹泻和10株食源株；克隆簇A与克隆簇B之间存在一定亲缘关系，见图 2。对抗生素敏感的散发病例株的优势分子型为1型，多见5岁以下幼儿(包括3例二次感染病例)，3例18型成人聚集性病例(图 2的outbreak 1)与食源株(鸭腿)有较高同源性；多重耐药株(MDR)病例多见20～79岁人群，回顾性流行病学调查确认MDR-ACSSuT和1例3型、1例21型暴发有关(图 2的outbreak 2和3)以及1例疑似暴发有关(图 2的like-outbreak)。这些蒙得维的亚的人源暴发株均表现为独立克隆，且彼此间有较高同源性，而人源MDR株的PFGE带型和食源的甲鱼、牛蛙和带鱼更匹配。

图 2 蒙得维的亚沙门菌PFGE聚类分析(限制性内切酶：XbaⅠ) Figure 2 Pulsed field gel electrophoresis patterns of S. Montevideo strains(restriction enzyme:Xba Ⅰ)
图选项
3 讨论

以南美洲国家乌拉圭的首都蒙得维的亚命名的沙门菌至今仍在美洲多个国家的食物中毒排名中占有优势[4, 6]。其在上海地区的沙门菌数据库(93种人源和76种食源沙门菌)属相对少见菌型，在国内其他区域亦有零星报道[7]。本次基于实验室诊断的沙门菌病例和食源性网络化监测提示本地区蒙得维的亚病例和高危食品的暴露有关，病例多发于5岁以下儿童和20~60岁男性，农村地区病例明显多于市区，与该型早期在美国的流行特征相符[4, 8]。男性病例多、农村病例高发可能与社交活动、不良卫生习惯或不洁饮食暴露史有关。

参照美国CDC对食源性暴发的定义：同时出现2例相同血清型和分子型病例。调查追溯3起成人蒙得维的亚沙门菌的暴发，儿童高度散发提示临床需重视新生儿的院内感染控制[4]。4例儿童二次感染病例提示家庭有传染源的可能，未见死亡和重症菌血感染病例可能缘于暴露剂量和机体免疫力等，美国曾有儿童罹患重症与死亡病例报道[4]。

沙门菌的MDR与其染色体或质粒携带的整合子相关[9]。美国国家肠道菌耐药监测系统(NARMS)2011年监测蒙得维的亚沙门菌65株(第7位血清型)中仅1株为MDR-ACSSuT合并头孢三嗪耐药[10]。相比之下，上海地区蒙得维的亚人源与食源株菌株耐药性均超过美国。分子聚类提示：2起MDR-ACSSuT暴发的传染源为甲鱼和带鱼，另1起非MDR暴发似源于鸭腿；其他散发病例和输入饲料、甲鱼、牛蛙、花蛤、螺蛳等菌株有较高同源性。推测蒙得维的亚沙门菌经境外污染的动物饲料输入并逐渐污染国内养殖生态，伴随河流的抗生素持续污染使细菌不断面临选择性耐药与进化压力，最终甲鱼的养殖特征决定其成为传播耐药克隆的生物载体[11]。境外优势流行的蒙得维的亚在上海地区尚处劣势，但其不断进化的MDR和非MDR稳定克隆均可分散而隐蔽的引发食源性暴发的监测证据值得国内的公共卫生机构重视[6, 12]。

欧、美等国对蒙得维的亚沙门菌暴发研究提示：暴发有点-源播散特征，归因于鸡、牛的养殖屠宰(肉制品)，随着企业养殖规模扩大并逐渐控制沙门菌的暴露风险后病例以分散暴发为主，传染源为受污染的加工食品[4, 13]。发达国家多部门合作控制大型养殖企业的食品安全防控经验值得借鉴，国内养殖企业(禽畜和水产)分散，而水产品养殖规模和产量已居世界第1位，随着城市化进程加速，人群消费模式将增加感染食源性耐药菌的生态型传染病风险和疾病负担[14-15]。

本研究获得的蒙得维的亚MDR克隆暴发案例和菌株数量有限，也缺少更深入的耐药机制研究，但基于人群和食源性沙门菌监测，以分子流行病学方法证实蒙得维的亚MDR在养殖产品和人群暴发间的关联，建议监管部门和企业(包括个体养殖户)在控制食源性暴露的同时，引入环境生态学(抗生素暴露风险控制)监测和评估的综合治理措施。

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