肠道病毒71 型(enterovirus 71，EV71)属于小RNA 病毒科(picornaviridae)、肠道病毒属(enterovirus)，是引起儿童手足口病最常见的病原体之一。病毒基因组仅有一个开放阅读框(open reading frame,ORF)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白可进一步被水解成 P1、P2和P3 3个前体蛋白。其中P1前体蛋白编码 VP1、VP2、VP3、VP4 4个病毒衣壳蛋白，而P2和P3区分别编码非结构蛋白2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D^[1]。作为单正链RNA病毒，肠道病毒在转录过程中易发生变异和重组，已有研究表明EV71普遍存在重组^[2]。为了解EV71在湖州地区的流行和变异情况，本实验室对20112012年湖州市手足口病患儿咽拭子标本中分离的EV71毒株进行了全基因组测序，并对其进行遗传进化和重组分析。

2011-2012年湖州市疾病预防控制中心收到的来自吴兴区、南浔区、长兴县、安吉县、德清县的手足口病疑似病例咽拭子，患者年龄在1月龄至12岁之间，主要集中在学龄前儿童。标本采集后-80℃保存备用。

按照《手足口病预防控制指南》(2009版)中病毒分离操作规程进行，将抗生素处理后的咽拭子标本分别接种Vero和RD细胞，置于37℃ 5% CO₂条件下培养，每天观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)情况，当CPE达到75%时收获上清液。采用QIAGEN公司的病毒核酸提取试剂盒(QIAamp@Viral RNA Mini Kit)进行病毒RNA提取。使用EV71分型引物、探针，应用荧光定量反转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)方法进行核酸检测，对收获的EV71毒株进行确认^[3]。

对2011年和2012年采集的174份和221份手足口病疑似病例标本进行病毒分离鉴定，经实时 Real-time RT-PCR方法确认收获EV71毒株24株(其中2011年10株，2012年14株)。按年度选取2株 EV71毒株(2011年毒株E371和2012年毒株E696)进行全基因组序列扩增和测定。引物设计参考文献^[4]，采用10对引物进行序列扩增，见表 1。RT-PCR反应试剂盒采用TaKaRa公司的One Step RNA PCR Kit(货号DRR024A)，反应条件：42 ℃反转录30 min；95 ℃预变性2 min； 95 ℃ 45 s、50 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。按照TaKaRa公司的5′FULL RACE kit试剂盒说明书进行5′末端的扩增。将有阳性条带的PCR扩增产物送大连宝生物工程有限公司测序。

利用DNAStar 7.0的SeqMan软件包对测序结果进行整理和拼接，MegAlign软件包进行核苷酸序列同源性分析。应用Clustal W 软件对测序结果进行多序列比对和分析，将EV71湖州株和EV71各基因型及A组肠道病毒其他血清型的原型株进行全序列比对，使用Mega 4.0软件绘制系统进化树。然后利用Simplot 3.5.1软件进行相似性分析，对基因重组加以验证。

通过序列测定和拼接获得EV71湖州株E371和E696的基因组全序列。E371和E696全长均为7406 bp (未包括polyA 尾)，基因组5′端和3′端各有长742 bp和82 bp的非编码区，中间为长6582 bp的编码区序列，编码2193个氨基酸的多聚蛋白。与参考序列相比，EV71湖州株编码区没有核苷酸的插入和缺失。两者全基因组的核苷酸序列同源性为91.5%，编码区的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为91.0%和98.5%。其中P1区、P2区、P3区的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.9%和99.5%、92.6%和99.0%、88.8%和96.8%。E371和E696的全基因组序列已上传GenBank，序列号分别为KJ784495和KJ784496。

将E371、E696、EV71与EV71各基因型、亚型代表株以及A组肠道病毒其他血清型的原型株进行全基因组序列的比对和分析，分别构建VP1区(2438~3328 bp)、P1区(VP4~VP1，743~3328 bp)，P2区(2A~2B，3329~5062 bp)和P3区(3A~3D，5063~7321 bp)的系统进化树，见图 1。结果显示，以VP1区、P1区构建的系统进化树中，EV71各基因型(A、B、C、D、E、F、G)、亚型(B0~B7、C1~C6)代表株与EV71湖州分离株相聚在一起形成一个大的分支，E371、E696与EV71 C4基因亚型代表株聚为一簇，属于C4基因亚型；以P2区和P3区构建的系统进化树中，E371、E696、EV71 C4及一些B基因亚型代表株则与A组肠道病毒柯萨奇病毒A组4型(Cox A4)、Cox A14、Cox A16血清型的原型株相聚在一起(bootstrap值为100%)，与EV71原型株BrCr/USA/1970相距较远。进一步采用Simplot软件对EV71湖州株与EV71各基因型及A组肠道病毒其他血清型的原型株进行全基因组序列的重组分析，见图 2。重组位点位于3814 bp左右(非结构蛋白2B编码区)，E371在重组位点3814 bp之前的衣壳蛋白区与EV71 C基因型原型株(NED/1991 AB575935)有着较高的相似性，在重组位点之后的非衣壳蛋白区E371则与柯萨奇病毒A组4型(Coxsachievirus A4,Cox A4)、A组14型(Cox A14)、A组16型(Cox A16)血清型的原型株有着较高相似性。相似性分析结果与之前的系统进化分析结果相符。分析结果显示，在3814 bp位点上游EV71 C基因型与B基因型也发生断点，但是B基因型与EV71湖州分离株全基因组各个部分的相似性相差不大，因此不支持湖州分离株发生了EV71 C基因型和B基因型的型内重组。

图 1 EV71全基因序列VP1区、P1区、P2区、P3区系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis of A VP1,B P1,C P2,D P3 regions of two EV71 strains with complete genome sequences

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图 2 EV71湖州分离株全基因序列的重组分析 Figure 2 Genetic recombination of EV71 isolated in Huzhou based on full-length genomes

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EV71是引起手足口病的主要病原体之一。近年来我国多个地区出现了EV71引起的手足口病疫情，主要感染5岁以下婴幼儿，个别患儿可因严重的中枢神经系统并发症而死亡，引起社会各界的广泛关注。目前，根据病毒VP1基因核苷酸序列的差异，EV71被分为A~G 7个基因型，B、C基因型又被进一步分别划分为 B0～B7 、C1～C6基因亚型，其中基因型内核苷酸序列差异<12%，型间差异为16.5%～19.7%^[5-6]。研究表明，1998年以来我国大陆流行的EV71几乎均为C4亚型，其中19982004 年的分离株为C4b亚型，20032008 年的分离株为C4a亚型^[7]。本研究中测得的EV71湖州分离株 E371和E696的全基因组核苷酸序列同源性为91.5%，氨基酸序列同源性为98.5%。两者的核苷酸序列差异主要位于非结构蛋白编码区P3区。基于病毒P1区(VP4~VP1)全序列的系统进化分析结果表明湖州地区2011年和2012年分离的2株EV71同样属于C4a亚型，与2004年以来中国大陆优势株流行趋势一致。

作为RNA病毒，肠道病毒在反转录过程中有高突变率和高重组率，是最易重组的病毒之一。不同型别肠道病毒或同一型别肠道病毒的不同毒株在非结构蛋白编码区以及非编码区都可能发生型别间或型别内的基因重组，极少数情况下，在结构蛋白编码区的3′末端也可能发生同源重组。已有研究表明EV71普遍存在重组，包括不同亚型EV71之间的型内重组和EV71与其他血清型肠道病毒间的型间重组^{[2, 8-9]}。重组在EV71进化过程中有着重要作用，可对其致病力和传播力产生一定的影响^[10-11]。van der Sanden等^[12]搜集了新西兰手足口病流行期和非流行期的EV71病毒株，利用病毒的5′UTR区进行系统进化分析，发现流行期的EV71可能在5′UTR区发生了重组。Zhang等^[13]同样发现2008年引起中国阜阳地区手足口病流行的EV71毒株可能在3D区与Cox A16发生了重组。Zhang等^[14]等进一步完成了中国大陆1998年以来手足口病流行期和非流行期的分离的EV71病毒株全基因组测序，并且运用EV71各基因型及A组肠道病毒其他血清型的原型株进行系统进化和重组分析。结果发现1998年以来中国大陆流行的EV71 C4型(包括C4a和C4b)属于重组株，其结构蛋白区基因来自EV71 C基因型而非结构蛋白区基因来自于Cox A16、14、4原型株。笔者运用同样的方法证实了EV71湖州分离株存在类似的型间重组，其重组位点于核苷酸位点3814附近，相对于EV71的非结构蛋白2B编码区。

流行病学资料显示^[15-16]，Cox A16常常和EV71交替或共流行造成手足口病频繁暴发，并且同一时期的手足口病例中可能还存在其他不同基因型别的肠道病毒流行，易发生肠道病毒间的基因重组。因此在手足口病病原学监测中，基于全基因序列测定和分析的分子监测有利于更加全面地认识病毒的分子特征，及时监测病毒变异及可能导致疾病暴发流行的重组事件。