疾病监测  2016, Vol. 31 Issue (11): 909-914

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梅玲玲, 徐昌平, 杨勇, 占利, 陈鸿鹄, 张云怡, 张俊彦, 陈建才, 程苏云
MEI Ling-ling, XU Chang-ping, YANG Yong, ZHAN Li, CHEN Hong-hu, ZHANG Yun-yi, ZHANG Jun-yan, CHEN Jian-cai, CHENG Su-yun
食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究
Alive foodborne pathogen Shigella detection by EMA real-time fluorescence PCR
疾病监测, 2016, 31(11): 909-914
Disease Surveillance, 2016, 31(11): 909-914
10.3784/j.issn.1003-9961.2016.11.006

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收稿日期：2016-05-04
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梅玲玲, 徐昌平, 杨勇, 占利, 陈鸿鹄, 张云怡, 张俊彦, 陈建才, 程苏云. 食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究[J]. 疾病监测, 2016, 31(11): 909-914.
MEI Ling-ling, XU Chang-ping, YANG Yong, ZHAN Li, CHEN Hong-hu, ZHANG Yun-yi, ZHANG Jun-yan, CHEN Jian-cai, CHENG Su-yun. Alive foodborne pathogen Shigella detection by EMA real-time fluorescence PCR[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(11): 909-914.
食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究
梅玲玲, 徐昌平, 杨勇, 占利, 陈鸿鹄, 张云怡, 张俊彦, 陈建才, 程苏云     
浙江省疾病预防控制中心, 杭州 310051
收稿日期: 2016-05-04
基金项目: 浙江省公益类科技计划项目（No.2015C37058）
作者简介: 梅玲玲,女,浙江省义乌市人,主任技师,硕士研究生,主要从事分子生物学及食源性致病菌检测技术研究工作
通信作者: 程苏云,Tel:0571-87115049,Email:llmei@cdc.zj.cn.
摘要: 目的 利用叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide，EMA）实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术，建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法。 方法 根据志贺菌ipaH基因保守序列设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件。用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性。用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性。同时用本研究方法和常规分离培养法，对30件模拟样品进行实样验证。 结果 志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值（Ct）=32.10~3.19×log（菌量）（R2=0.994）。最低检测浓度为2.20 CFU/反应。对死菌DNA抑制效率≥99.97%。31株志贺菌Ct值最低为15.04，最高为26.54，而97株非志贺菌的Ct值均>35或无Ct值（呈一条直线）。重复试验Ct值变异系数<3。30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致，但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5 h，而常规分离培养方法则需要3～5 d。 结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法，建议在食品检测中推广应用。
关键词： 食品     志贺菌     叠氮溴乙锭     实时荧光PCR    
Alive foodborne pathogen Shigella detection by EMA real-time fluorescence PCR
MEI Ling-ling, XU Chang-ping, YANG Yong, ZHAN Li, CHEN Hong-hu, ZHANG Yun-yi, ZHANG Jun-yan, CHEN Jian-cai, CHENG Su-yun     
Department of Microbiology, Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, Zhejiang, China
Corresponding author: CHENG Su-yun,Email:llmei@cdc.zj.cn.
Abstract: Objective A detection assay for alive Shigella in food was developed by using of ethidium monoazide bromide (EMA) real-time fluorescence PCR technology, which is convenient, rapid, specific and sensitive. Methods The conserved ipaH gene was chose as the specific primer and probe to detect Shigella. Samples were pretreated with EMA at different concentrations and irradiating times. The detection sensitivity, specificity and stability were evaluated by using 31 Shigella strains, 26 Listeria monocytogenes strains, 24 Salmonella strains, 25 Vibrio parahemolyticus strains, 11 Cronobacter sakazakii strains, 10 Enteropathogenic Escherichia coli strains, and 1 E. coli strain, and the comparisons of the specificity and stability in detection of 30 simulated samples were made between newly developed EMA real-time fluorescence PCR assay and routine culture. Results The Ct value of EMA real-time fluorescence PCR for alive Shigella was 32.10-3.19×log (bacteria load).The lowest limit of detection was 2.20 CFU per reaction. More than 99.97% of PCR reaction for dead strains was inhibited. The Ct values of 31 Shigella strains were between 15.04 and 26.54, while 97 non-Shigella strains had Ct values>35 or had no Ct values (one horizontal line appeared). The variation coefficient of Ct was less than 3 when same samples were tested every other day for five times. The results of the detections of 30 simulated samples were consistent by either using newly developed EMA real-time fluorescence PCR or routine culture, but the test time was shortened from 3-5 days (routine culture)to less than 7.5 h. Conclusion The newly developed EMA real-time fluorescence PCR for alive Shigella is rapid, convenient, specific and sensitive, it is recommended to use it in food inspection.
Key words: Food     Shigella     Ethidium monoazide bromide     Real-time fluorescence PCR    

志贺菌可引起细菌性痢疾和食物中毒,全球每年因志贺菌感染的人次估计为1.65亿,可造成110万人死亡,细菌性痢疾的发病率和死亡率均居感染性腹泻之首位[1]。细菌性痢疾是我国传染病防治法中规定报告的乙类传染病,志贺菌是主要食物中毒病原菌之一[2-3]。志贺菌的传染源为患者和带菌者,主要通过食用被志贺菌污染的食品而感染发病。我国多种食品卫生标准中规定不得检出志贺菌。

目前食品中志贺菌的检测主要通过培养法分离、鉴定,整个过程操作繁琐,耗时长,检出率低。实时荧光聚合酶链反应(PCR)方法具有敏感性、特异性高和稳定性强等特点,可很好地弥补上述不足。但由于相当一部分志贺菌在食品加工过程中已经死亡,DNA却能在死菌中保留很长时间,造成传统的实时荧光PCR方法检测结果为阳性,干扰了检测的真实性,使食品中志贺菌实时荧光PCR检测技术的推广应用受到很大的限制。

本文应用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)能穿过死细菌的细胞膜,在光激活的作用下与基因组DNA共价结合,抑制样品中死菌体的DNA进行PCR扩增的特性[4-5],将EMA与PCR技术结合,建立了EMA实时荧光PCR技术,该技术可快速、准确和特异性地检测食品中的志贺活菌,现将结果报道如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验用菌株

痢疾志贺菌(CMCC 51570)、宋内志贺菌(CMCC 51334)、福氏志贺菌(CMCC 51573 )、鸭沙门菌(CMCC 50083)、伤寒沙门菌(CMCC 50079)、鼠伤寒沙门菌(CMCC 50013)、甲型副伤寒沙门菌(CMCC 50002)、副溶血弧菌(ATCC 17802、ATCC 33847)、阪崎肠杆菌(ATCC 51329)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、单增李斯特菌(CMCC 54001)和金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)等标准菌株均购自中国生物制品检定所和中国微生物菌种保藏中心。17株福氏志贺菌、11株宋内志贺菌、20株沙门菌、25株单增李斯特菌、10株致病性大肠埃希菌、10株阪崎肠杆菌和23株副溶血弧菌由本实验室自食品或患者粪便标本中分离获得。

1.1.2 仪器和试剂

7500Fast实时荧光定量PCR仪为美国life technology公司产品。EMA购自美国Biotium公司,PCR反应试剂(DRR039S)购自宝生物工程(大连)有限公司。所有相关培养基均购自英国OXOID公司,经鉴定合格,在有效期内使用。

1.1.3 引物和探针

用DNAMan 7.0软件分析比较NCBI网站发布的志贺菌ipaH基因。选择志贺菌ipaH基因保守序列(登录号M32063.1),用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针。在探针5′端标记报告荧光染料6-Carboxyfluorescein(FAM),3′端标记淬灭荧光染料BHQ1。引物和特异性探针委托美国life technology公司合成。特异性引物和荧光探针序列：上游引物(ipaHF)5′-CAG GCA TCA GAA GGC CTT TT-3′,下游引物(ipaHR)5′-TCG AGG CGG AAC ATT TCC-3′,荧光探针(ipaHpb)5′-FAM-CGG CGC TCT GCT CTC CCT GG-BHQ1-3′。

1.2 方法 1.2.1 志贺菌实时荧光PCR检测方法 1.2.1.1 食品样品取样

称取或吸取食品样品10 g,放至盛有90 ml稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1～2 min,制成匀液,1000 r/min,离心5 min,取上清,3000 r/min离心10 min,去上清,沉淀加无菌生理盐水1 ml溶解后移至1.5 ml eppendorf管(EP管)。若为菌培养物,则直接吸取1 ml至1.5 ml EP管。

1.2.1.2 DNA核酸提取

100 ℃10 min,10 000 r/min离心5 min,吸取上清作为模板DNA,-40 ℃保存备用。

1.2.1.3 反应体系

包括2×Premix Ex TaqTM 10 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl,探针 (10 μmol/L)0.8 μl,ROX 0.2 μl,模板DNA 为 3.0 μl,用ddH2O补足至20 μl。

1.2.1.4 反应条件

预变性95 ℃ 30 s,变性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 40 s,40个循环。在60 ℃处设定荧光检测点。荧光检测模式选择FAM荧光,基线调整取3～15个循环的荧光信号,以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线。

1.2.1.5 结果判断

若待测样品荧光增长曲线超过阈值线,并呈良好的对数增长,循环阈值(Ct) 值≤30,判断为阳性。若Ct值>30或无Ct值,则判断为阴性。

1.2.2 志贺菌EMA实时荧光PCR检测方法

样品EMA前处理按1.2.1.1方法称取10 g样品,至盛有90 ml稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1～2 min,制成匀液,1000 r/min,离心5 min,取上清,3000 r/min,离心10 min,去上清,沉淀加无菌生理盐水1 ml溶解后移至1.5 ml EP管。若为菌培养物,则直接吸取1 ml至 1.5 ml EP管即可。然后按1.2.3实验结果获得的最佳EMA作用浓度和处理次数对样品进行光处理,用生理盐水沉淀3次后用于DNA核酸提取。DNA核酸提取、反应体系、反应条件、结果判断方法同1.2.1。

1.2.3 EMA作用浓度和处理次数优化方法

取0.5麦氏浓度的志贺菌(CMCC 51573 )悬液3.0 ml,95 ℃加热10 min彻底杀死细菌后,分别置1.5 ml EP管,每管 200 μl,按EMA终浓度为0、5、10、20和30 μg/ml,光处理(黑暗处放置8 min,650 W卤素灯光照8 min)1次、2次和3次作矩阵配比,进行EMA前处理和实时荧光PCR检测。对同浓度的志贺活菌用同样的方法进行EMA前处理和实时荧光PCR检测。选择同一EMA作用条件死菌、活菌Ct值相差最大,即对死菌抑制效果高,对活菌影响最小的EMA作用条件作为本次实验的最佳EMA作用浓度和处理次数。

1.2.4 对志贺死菌抑制性验证

取浓度为7.3×107 CFU/ml、7.3×106 CFU/ml、7.3×105 CFU/ml、7.3×104 CFU/ml经95 ℃加热10 min的志贺死菌(CMCC 51573)各2 ml,分别置1.5 ml EP管,每管 1 ml,离心,沉淀用100 μl TE溶解,其中,1管不作EMA前处理、1管按最佳的EMA作用浓度和处理次数进行EMA前处理。然后将2种处理方法的样品,重复3次,同时开展实时荧光PCR检测,以验证方法对死菌抑制效果。

对死菌DNA抑制效率计算方法：将用EMA实时荧光PCR扩增测得的平均Ct值,代入到未经EMA处理的Ct＝39.96-3.168×log(菌量)公式,换算出EMA处理后死菌的DNA扩增浓度。再用1－(EMA处理后死菌的DNA扩增浓度/实际死菌浓度)×100得出死菌DNA抑制效率。

1.2.5 敏感性验证

取志贺菌(CMCC 51573)悬液1.0 ml,作10倍梯度稀释成100 ～10-6 7种浓度,各取1 ml,离心,去上清,加100 μl TE溶解沉淀后,按最佳的EMA作用浓度和处理次数进行EMA前处理、实时荧光PCR扩增,以验证方法的敏感性。同步用营养琼脂作平板计数法进行菌落计数结果,100 菌浓度为7.3×107 CFU/ml,各反应管菌量分别为2.2×105 CFU/反应、2.2×104 CFU/反应、2.2×103 CFU/反应、2.2×102CFU/反应、2.2×101 CFU/反应、2.2CFU/反应和0.22 CFU/反应。

1.2.6 特异性验证

用3株志贺菌标准株、28株志贺菌分离株以及98株非志贺菌(沙门菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、致病性大肠埃希菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等)菌悬液,进行EMA实时荧光PCR扩增,以验证方法的特异性。

1.2.7 稳定性验证

对1株志贺菌标准菌株(CMCC 51573)、2株志贺菌分离株、1株沙门菌(CMCC 50013)和1株大肠埃希菌标准株(ATCC 25922)隔天连续重复5次进行EMA实时PCR检测,通过计算反应Ct值变异系数(coefficient of variation,CV)验证方法的稳定性。

1.2.8 模拟样品检测

取15份熟肉制品,15份饮料,各称或吸取25 g到225 ml GN增菌液中,其中每类样品有4份添加了活的志贺菌(菌浓度约为10 CFU/ml、102 CFU/ml、103 CFU/ml和104 CFU/ml),4份添加了死的志贺菌(菌浓度约为104 CFU/ml),2份既添加了死的志贺菌(菌浓度约为104 CFU/ml)、又添加了活的志贺菌(菌浓度约为103 CFU/ml),5份样品未添加任何菌,所有样品中添加了大肠埃希菌(菌浓度约为104 CFU/ml)。用GN增菌液增菌 5 h后,各吸取1 ml,按最佳的EMA作用浓度和处理次数进行EMA前处理方法后,进行EMA实时荧光PCR扩增。同步按《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》(GB 4789.5-2012)方法进行常规分离培养,以验证2种方法的一致性。

2 结果 2.1 EMA作用浓度和处理次数优化结果

将EMA终浓度为0、5、10、20和30 μg/ml,光处理(黑暗处放置8 min,650 W卤素灯光照8 min)1次、2次和3次进行矩阵配比设计死、活菌各15种排列组合,同时进行EMA前处理和实时荧光PCR检测结果,不加EMA的3种死菌组合和3种死菌组合Ct值在同一水平,Ct值在15.06～15.68之间。加EMA的12种死菌组合Ct值在22.07～29.41之间。EMA对志贺菌死菌DNA的抑制能力随着EMA浓度和光处理次数增加不断提升,但EMA浓度的提升效率明显高于光处理次数。进一步根据加EMA的12种活菌组合Ct值在15.34～16.74之间。EMA对志贺菌死菌DNA的抑制能力随着EMA浓度和光处理次数增加不断提升,但EMA浓度的提升效率明显高于光处理次数(表 1)。最终确定EMA终浓度为30 μg/ml,光处理(黑暗处放置8 min,650 W卤素灯光照8 min)1次作为本研究的最佳EMA作用浓度和处理次数。

表 1 EMA作用浓度和处理次数优化结果(Ct值) Table 1 Optimization of EMA processing concentrations and times
编 号12345678910
EMA终浓度 (μg/ml)0 5 10 20 30 0 5 10 20 30
光处理次数115.5122.1123.8728.2629.4115.3815.3415.5315.6215.67
215.2522.0723.1327.0329.9115.4315.5815.4416.2815.40
315.6822.4023.5726.4228.4315.0615.7816.1815.3616.74
注：1～5号加志贺死菌(CMCC 51573)； 6～10号加同浓度的志贺活菌(CMCC 51573)。
表选项
2.2 EMA前处理方法对志贺死菌抑制性验证结果

取浓度为7.3×107 CFU/ml、7.3×106 CFU/ml、7.3×105 CFU/ml和7.3×104CFU/ml 4种菌量的志贺菌死菌重复3次同时进行EMA不处理、前处理2种方法的实时荧光PCR扩增结果,未经EMA前处理的4种浓度死菌样品平均Ct值分别为15.23、17.98、21.34和24.69,Ct＝39.96-3.168×log(菌量)(R2=0.999)。经EMA处理的4种浓度死菌样品平均Ct值分别为26.36、30.03、34.96和36.33,Ct＝54.09-3.484×log(菌浓度)(R2=0.961)。经Ct＝39.96-3.168×log(菌量)公式换算后计算,每种浓度的死菌DNA抑制效率≥99.97%。当样品中志贺死菌浓度<105 CFU/ml时,Ct>35,见表 2。

表 2 不同条件下对志贺菌荧光定量PCR技术检测结果 Table 2 Detection results of Shigella by real-time fluorescence PCR under different conditions
菌浓度(CFU/ml)EMA未处理管(活菌) EMA处理管(活菌) EMA处理管(死菌) 死菌抑制效率(%)
Ct1Ct2Ct3平均Ct1Ct2Ct3平均Ct1Ct2Ct3平均
7.3×10715.1315.3215.2315.2315.2415.3815.4715.3626.4826.2526.3426.36＞99.97
7.3×10617.9118.0517.9817.9818.3218.1518.2918.2530.1229.8930.0830.03＞99.98
7.3×10521.2421.5421.2321.3421.3521.5821.4021.4435.2134.6834.9934.96＞99.99
7.3×10424.5424.8824.6424.6924.3824.7924.9724.7036.9435.5936.4636.33＞99.98
表选项
2.3 敏感性验证结果

分别用浓度为2.2×105 CFU/反应、2.2×104 CFU/反应、2.2×103 CFU/反应、2.2×102CFU/反应、2.2×101 CFU/反应、2.20CFU/反应和0.22 CFU/反应 7种浓度志贺菌菌培养物进行EMA实时荧光PCR扩增结果,Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系,Ct＝32.10-3.19×log(菌量),R2=0.994。方法的最低检测浓度达到2.20 CFU/反应(图 1)。

图 1 志贺菌EMA实时荧光PCR检测技术敏感性检测结果 Figure 1 Sensitivity of EMA real-time fluorescence PCR to detect Shigella
图选项
2.4 特异性验证结果

对3株志贺菌标准株、28株志贺菌分离株以及97株非志贺菌(沙门菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、致病性大肠埃希菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等)菌悬液进行EMA实时荧光PCR扩增结果显示,3株志贺菌标准株和28株志贺菌分离株Ct值最低为15.04,最高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均>35或无Ct值(呈一条线)。部分菌株的扩增结果见图 2。

图 2 部分菌株志贺菌EMA实时荧光PCR检测结果 Figure 2 Detection results of some Shigella strains by EMA real-time fluorescence PCR
图选项
2.5 重复性验证结果

对志贺菌标准菌株(CMCC 51573)、2株志贺菌分离株、1株沙门菌(CMCC 50013)和1株大肠埃希菌标准株(ATCC 25922)隔天连续重复5次进行EMA实时荧光PCR检测,5种细菌均能够正确判定,除2种阴性菌部分结果无Ct值,无法计算CV外,其余3株菌Ct值的CV均<5%，见表 3。

表 3 EMA实时PCR检测的重复性检测结果 Table 3 Repeatability of EMA real-time fluorescence PCR detection
样 品Ct1Ct2Ct3Ct4Ct5Ct(M)sCV(%)
志贺菌标准菌株(CMCC 51573)16.6216.0716.9316.3316.3016.450.260.96
志贺菌分离株(14-Y-1222)19.9819.0918.9918.1418.5818.960.371.48
志贺菌分离株(14-Y-1251)18.0116.5116.7120.5718.6818.090.813.24
沙门菌 (CMCC 50013)35.0236.1635.37-----
大肠埃希菌 (ATCC 25922)35.89-------
表选项
2.6 志贺菌EMA实时荧光PCR检测技术对模拟样品检测

对分别添加志贺菌活菌、死菌或不加任何菌的15份饮料,15份熟肉制品,按最佳的EMA作用浓度和处理次数进行EMA前处理方法后,同时进行EMA实时荧光PCR扩增和常规分离培养结果,4份添加活的志贺菌和2份既添加死的志贺菌又添加活的志贺菌样品,用2种方法检测结果均为阳性,其余样品均为阴性。EMA实时荧光PCR检测结果与常规分离培养方法完全一致,见表 4。

表 4 2种方法对不同带菌量模拟样品的检测结果 Table 4 Detection results of simulated samples with different bacteria load by two methods
编 号123456789101112131415
活志贺菌量(CFU/ml)10102103104000010310300000
死志贺菌量(CFU/ml)000010410410410410410400000
大肠埃希菌量(CFU/ml)104104104104104104104104104104104104104104104
饮料检测EMA-PCR法＋＋＋＋----＋＋-----
常规分离法＋＋＋＋----＋＋-----
熟肉制品检测EMA-PCR法＋＋＋＋----＋＋-----
常规分离法＋＋＋＋----＋＋-----
注：“+”表示阳性或检出；“-”表示阴性或未检出。
表选项
3 讨论

实时荧光PCR 技术是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新核酸检测技术,其通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,该技术的出现,极大地简化了各类检测过程[6],现已广泛应用于禽流感病毒、人类免疫缺陷病毒、霍乱弧菌、沙门菌和志贺菌等病原微生物的诊断领域[7]。然而,以核酸为基础的PCR检测方法,无法有效地区分细胞的死活,也就是说,无论是活细胞,还是死细胞均能扩增出目标基因。对于食品这类样品,在加工过程中,多数病原菌已被杀死,这些死菌或自由状态的DNA已经不会对人体造成危害,却仍然被检测出来,导致假阳性结果和较低的准确性,从而限制了PCR检测方法在食品检测领域的推广使用。EMA作为一种光敏感的DNA染料,能渗透到细胞壁或细胞膜不完整的死细胞体内,并插入DNA共价结合,共价结合的DNA,用PCR 检测方法不能发生扩增。而活细胞具有完整细胞壁、细胞膜,能够阻止EMA 渗透到菌体内与DNA共价结合,其PCR扩增不受影响,从而可有效地检测区分死、活病原细菌[8-9]。从本次建立的EMA实时荧光PCR技术研究结果看,志贺菌EMA实时荧光PCR检测技术Ct值与待检菌对数值具有很好线性关系(R2=0.994)。方法的最低检测浓度达到了2.2 CFU/反应。而对死菌DNA抑制效率≥99.97%,对沙门菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、大肠埃希菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等的Ct均>35或无Ct。对5种不同细菌重复检测5次,Ct值CV均<5%,对分别添加了志贺菌活菌、死菌或不加任何菌的15份奶粉,15份熟肉制品,同时进行EMA实时荧光PCR扩增和常规分离培养结果2种方法完全一致。表明志贺菌EMA实时荧光PCR检测技术即具有荧光定量PCR的特异性强,敏感度高,简便、快速的优点,又仅能检测食品中志贺活菌,这对将实时荧光PCR等DNA快速技术在食品领域的推广使用具有深远的作用与意义。

本次实验结果表明,EMA的作用效率首先与光照强度密切相关。用650 W卤素灯光照,需要提前10 min将灯打开预热。照射时要尽量接近光源,但必须避免高温对核酸的破坏,可以通过将装待处理样品的EP管插在冰盒中来解决此问题。其次,EMA的作用效率与EMA浓度密切相关,EMA终浓度在5～30 μg/ml的范围内,EMA对志贺菌死菌DNA的抑制能力随着EMA浓度和光处理次数增加不断提升,但提升效率EMA浓度明显高于光处理次数。最终本研究认为EMA终浓度为30 μg/ml,光处理(黑暗处放置8 min,650 W卤素灯光照8 min) 1次是最佳EMA作用浓度和处理次数,死菌DNA扩增效率<0.01%。

作者贡献:

梅玲玲：负责方案设计、论文撰写,主要实验室研究

徐昌平：负责引物设计

杨勇：负责英文摘要翻译、实验研究

占利、陈鸿鹄、张云怡、张俊彦、陈建才：参与实验研究

程苏云：负责方案、文章审核

参考文献
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