一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

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石伟先, 张靖, 孙瑛, 刘医萌, 潘阳, 赵佳琛, 张代涛, 崔淑娟, 彭晓旻, 卢桂兰, 陈丽娟, 王全意, 杨鹏

SHI Wei-xian, ZHANG Jing, SUN Ying, LIU Yi-meng, PAN Yang, ZHAO Jia-chen, ZHANG Dai-tao, CUI Shu-juan, PENG Xiao-min, LU Gui-lan, CHEN Li-juan, WANG Quan-yi, YANG Peng

一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

Application of a rapid nucleic acid extraction kit in detection of influenza virus nucleic acid

疾病监测, 2016, 31(11): 915-919

Disease Surveillance, 2016, 31(11): 915-919

10.3784/j.issn.1003-9961.2016.11.007

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收稿日期：2016-05-19

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石伟先, 张靖, 孙瑛, 刘医萌, 潘阳, 赵佳琛, 张代涛, 崔淑娟, 彭晓旻, 卢桂兰, 陈丽娟, 王全意, 杨鹏. 一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价[J]. 疾病监测, 2016, 31(11): 915-919. 复制到剪切板

SHI Wei-xian, ZHANG Jing, SUN Ying, LIU Yi-meng, PAN Yang, ZHAO Jia-chen, ZHANG Dai-tao, CUI Shu-juan, PENG Xiao-min, LU Gui-lan, CHEN Li-juan, WANG Quan-yi, YANG Peng. Application of a rapid nucleic acid extraction kit in detection of influenza virus nucleic acid[J]. Disease Surveillance, 2016, 31(11): 915-919. 复制到剪切板

一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

石伟先¹, 张靖², 孙瑛¹, 刘医萌¹, 潘阳¹, 赵佳琛¹, 张代涛¹, 崔淑娟¹, 彭晓旻¹, 卢桂兰¹, 陈丽娟¹, 王全意¹, 杨鹏¹

1. 北京市疾病预防控制中心, 北京市预防医学研究中心, 北京 100013;
2. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京 102206

收稿日期: 2016-05-19

基金项目: 北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目（No.2013-3-098）；北京市优秀人才培养资助青年拔尖个人项目（No.2014000021223ZK36）；北京市科技计划课题（No.D141100003114001）

作者简介: 石伟先,女,辽宁省沈阳市人,主任技师,硕士,主要从事呼吸道病毒检验研究

通信作者: 杨鹏,Tel:010-64407108,Email:yangpengcdc@163.com.

摘要: 目的探讨一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的适用性及有效性。方法选取流感病毒H3亚型、乙型Yamagata系细胞株和甲型H1N1型鸡胚株各1株，对其倍比稀释液及2015年北京市流感病原学监测阳性的67份咽拭子样本，同时采用快速提取法及离心柱提取法提取病毒核酸，经实时荧光PCR法进行定性、定量检测，检测结果采用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果快速提取法提取细胞培养液、鸡胚培养液中流感病毒核酸的最低检测限高于离心柱法10倍，咽拭子样本则高100倍；快速提取法提取核酸后检测到的病毒载量均低于离心柱法，其中对含有病毒量较高的毒株检测到的病毒载量低于离心柱法10倍，而对病毒量较少的咽拭子样本，则低100倍；快速提取法稳定性优于离心柱法；提取后的核酸-80℃保存10 d后冻融复测，快速提取法核酸损失量大于离心柱法。67份离心柱提取法检测阳性咽拭子样本使用快速提取法提取核酸后检测，两种方法阳性符合率总计为92.54%，其中10～10²拷贝/ml组，阳性符合率为76.92%，10²～10³拷贝/ml组，阳性符合率为92.59%，>10³拷贝/ml组，阳性符合率为100%。结论快速提取法具有稳定性高、易于操作、不易污染的优势，适用于细胞培养液、鸡胚培养液等病毒含量较高的大量样本中流感病毒核酸提取，适于检测样本量大、人手不足、设备欠缺的基层实验室使用；但-80℃冻融后核酸损失量较大，不宜反复冻融后使用；传统的离心柱法对于病毒含量较少的咽拭子样本及核酸需被反复冻融使用时具有优势。

关键词：流感病毒核酸快速核酸提取试剂离心柱法

Application of a rapid nucleic acid extraction kit in detection of influenza virus nucleic acid

SHI Wei-xian¹, ZHANG Jing², SUN Ying¹, LIU Yi-meng¹, PAN Yang¹, ZHAO Jia-chen¹, ZHANG Dai-tao¹, CUI Shu-juan¹, PENG Xiao-min¹, LU Gui-lan¹, CHEN Li-juan¹, WANG Quan-yi¹, YANG Peng¹

1. Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 100013, China;
2. National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

Corresponding author: YANG Peng,Email:yangpengcdc@163.com.

Abstract: Objective To evaluate the applicability and effectiveness of a rapid nucleic acid extraction kit in the detection of influenza virus. Methods Ten-fold dilutions from influenza virus (one H3 strain, one BY cell strain and one pdm09 H1N1 embryo strain) and 67 throat swabs positive for influenza virus collected in Beijing in 2015 were selected for the study. The viral nucleic acids were extracted by the novel rapid extraction method and spin column extraction method simultaneously. Real-time fluorescent PCR were used for qualitative and quantitative detections, and the results were analyzed with software SPSS 19.0. Results For the influenza virus cell strain and embryo strain, the detection limitation of the rapid extraction kit for influenza virus nucleic acid was 10 times higher than that of the spin column extraction method and 100 times higher than that of swab detection. The virus load detected by rapid extraction was lower than that by spin column extraction (10 times lower for samples with more viral particles and 100 times lower for swabs with less viral particles). For the stability, the rapid extraction kit was better than the spin column extraction method. The nucleic acid loss caused by rapid extraction due to re-freezing and re-thawing at -80℃ for 10 days was greater than the spin column extraction. Based on the quantitative detection results of spin column extraction, 67 swabs were divided into different viral load groups. By real time RT-PCR for qualitative detection, the total positive consistent rate for rapid extraction and spin column extraction was 92.54%. For the 10-10² copies/ml group, the positive consistent rates were 76.92%, 92.59% for 10²-10³ copies/ml group, 100% for>10³ copies/ml group. Conclusion The novel rapid nucleic acid extraction kit has some advantages such as high stability, easy to operate, hard to be polluted, and is appropriate for the nucleic acid extraction from the strains such as cell culture fluid, chick embryo culture fluid which contain more viral particles. Though the novel rapid nucleic acid extraction was more suitable for grass root laboratories which deal with large number of samples, lack staff and equipment, it is not appropriate to use nucleic acid after re-freezing and re-thawing due to the loss of nucleic acid after freezing at -80℃.The traditional spin column extraction method has advantages for the nucleic acid extraction from swabs which contain less viral particles and is more appropriate for the nucleic acid to be reused after re-freezing and re-thawing.

Key words: Influenza virus nucleic acid Rapid nucleic acid extraction kit Spin column extraction method

流行性感冒(流感)病毒是一种负链RNA病毒,具有易变性,其导致的流感传播快,发病急,易引起暴发流行。快速、准确获得病原学结果并对病毒变异、耐药情况等进行监测是流感防控和临床治疗的关键^[1-4]。因此,核酸检测和基因特性分析等分子生物学检测技术在流感病毒监测中应用极其广泛。核酸提取作为分子生物学检测的首要步骤,提取质量、效率及简便性等常为实验人员考量的要素。本研究通过对一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用开展评价,旨在探讨该法适用性及有效性。

1 材料与方法 1.1 样本来源

MDCK细胞株A/北京朝阳/1211/2015(H3)、B/北京朝阳/1287/2015(乙型Yamagata系)、鸡胚分离株A/北京西城/SWL1642/2014(H1)为本室留存,其血凝滴度分别为1∶8、1∶16和1∶8,毒株均经PBS 10倍倍比稀释,获得不同浓度的流感病毒；同时选取2015年北京市流感病原学监测阳性咽拭子67份。所有毒株及样本均分装后于-80 ℃冻存。

1.2 核酸提取

分别使用QIAmp viral RNA mini kit试剂盒(QIAGEN公司)、MOKOGENE^TM拭子病毒RNA快速提取试剂盒(南京美宁康诚生物有限公司)。提取方法按试剂盒说明书进行,QIAGEN离心柱法加入样本140 μl,洗脱液使用140 μl。快速提取法使用样本50μl,加入5 μl FastLyse L4,振荡混匀,95 ℃ 2 min,12 000 r/min离心2 min,吸上清用于实时荧光RT-PCR检测。提取的核酸即时检测后于-80 ℃保存。

1.3 定量标准品的制备

提取毒株A/北京西城/157/2011(H3)(本实验室分离留存)RNA,使用QIAGEN OneStep RT-PCR kit(QIAGEN公司),用甲型流感病毒基质蛋白(influenza A matrix protein,Am)基因特异性引物进行PCR反应。反应体系配制参照试剂盒说明书,反应程序为50 ℃ 30 min,95 ℃ 15 min，(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s)共40个循环,72 ℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,Am基因片段经QIAGEN Gel extraction kit(QIAGEN公司)纯化回收后连接于pMD18-T质粒载体(Promega公司产),经转化、增菌后提取重组质粒,经PCR及测序,鉴定重组质粒中目标片段为正确的Am基因片段。依照公式拷贝数＝(质量÷分子量)×6.02×10²³,由纯化后的重组质粒质量浓度(g/μl)换算为拷贝浓度(拷贝/μl)后,稀释制备10⁰~10⁶ 拷贝/ml,7个浓度梯度定量标准品。

1.4 实时荧光RT-PCR检测

Am基因和乙型流感病毒非结构蛋白NS(influenza B non structure protein)基因的引物、探针序列参考国家流感中心下发全国流感监测方案(2010年版)附件《流感监测实验技术操作规范》,由上海生工生物工程有限公司合成。按照Ag-path ID one-step RT-PCR kit(Life Technologies公司)试剂盒说明书配制反应体系,反应程序为45 ℃ 10 min,95 ℃ 10 min，(95 ℃ 15 s,60 ℃ 45 s)共45个循环,60 ℃ 45 s阶段收集荧光信号,通过使用Am基因的定量标准品获得检测样本拷贝数(拷贝/ml),所有检测重复3次,取其平均值作为最终检测结果。

1.5 统计分析

采用Excel 2003软件建立数据库,应用SPSS 19.0统计软件进行分析。对两种方法提取不同类型样本中病毒RNA扩增后靶基因拷贝数结果比较及-80 ℃保存对核酸的影响结果的比较采用配对t检验,变异系数的比较采用u检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同类型样本的检测灵敏度

对不同类型样本10倍系列稀释物提取核酸后的定性检测结果显示,细胞株A/北京朝阳/1211/2015(H3)、B/北京朝阳/1287/2015(乙型Yamagata系),鸡胚分离株A/北京西城/SWL1642/2014(H1),快速提取法提取核酸的最低检测限均高于离心柱法10倍,咽拭子样本快速提取法的最低检测限高于离心柱法100倍,详见表 1。

表 1 快速提取法及离心柱法对不同类型样本中核酸检测灵敏度的比较 Table 1 Comparison of sensitivity of rapid extraction and spin column extraction in RNA detections from different samples

样本类型提取方法	细胞培养液1⁽¹⁾		细胞培养液2⁽²⁾		鸡胚分离液		咽拭子
样本类型提取方法	M⁽³⁾	Q⁽⁴⁾	M	Q	M	Q	M	Q
最低检测限⁽⁵⁾	10^-11	10^-12	10^-10	10^-11	10^-6	10^-7	10^-3	10^-5
最低检测限的定量检测结果(拷贝/ml)	1.16	1.61	1.15	0.73	1.38	1.15	0.95	1.22
注：(1) 细胞培养液1：毒株A/北京朝阳/1211/2015(H3)细胞培养液;(2) 细胞培养液2：毒株B/北京朝阳/1287/2015(乙型Yamagata系)细胞培养液;(3) M： MOKOGENE快速提取法；(4) Q：QIAGEN 离心柱法；(5) ：可检测到的最高稀释倍数。

表选项

定量检测结果以拷贝/ml为单位,取其3次平行检测的对数平均值,作为该方法检测该稀释度样本的结果,分析显示,对不同类型不同稀释度样本,快速提取法提取核酸后检测到的病毒载量均低于离心柱法。计算两种方法定量检测结果所得的log(拷贝/ml)值之差,结果显示,细胞株A/北京朝阳/1211/2015(H3)差值的中位数为1.04 (0.59~1.40),细胞株B/北京朝阳/1287/2015(乙型Yamagata系)差值的中位数为0.945(0.57~1.54),鸡胚分离株A/北京西城/SWL1642/2014(H1)差值的中位数为0.96(0.71~1.21),咽拭子差值的中位数最高,为1.90(1.01~2.36)。使用配对t检验对两种提取方法检测不同类型样本的定量检测结果进行统计学检验,结果显示快速提取法与离心柱提取法相比,快速提取法提取的核酸量低于离心柱法,具有统计学意义(t=15.20,P=0.000),其中以对咽拭子样本的提取量差异最大。见图 1。

图 1 快速提取法与离心柱法对不同类型样本检测结果的差异比较 Figure 1 Difference in detection of different samples between rapid extraction and spin column extraction 注：Δlog(拷贝/ml)=快速提取法3次平行检测样本中拷贝/ml的对数平均值-离心柱法3次平行检测样本中拷贝/ml的对数平均值;细胞培养液1：毒株A/北京朝阳/1211/2015(H3)细胞培养液;细胞培养液2：毒株B/北京朝阳/1287/2015(乙型Yamagata系)细胞培养液。

图选项

2.2 方法可重复性

选取细胞株A/北京朝阳/1211/2015(H3)培养液,分别稀释10倍、10³倍及10⁵倍作为高浓度、中浓度及低浓度样本,使用快速提取法及离心柱法对每样本均进行6次平行核酸提取及扩增检测,依据其定量结果对数值,计算不同方法的变异系数(coefficient of variation,CV)值,结果可见,两种方法CV均随样本稀释倍数的增加而增加,快速提取法的CV均小于离心柱法,见表 2。

表 2 快速提取法与离心柱法重复性检测结果 Table 2 Comparison of repeated test results between rapid extraction and spin column extraction

病毒稀释倍数	提取有效次数	快速提取法⁽¹⁾			离心柱法⁽¹⁾			统计检验
病毒稀释倍数	提取有效次数	x	s	CV(%)	x	s	CV(%)	统计检验
10	6	5.21	0.04	0.77	6.35	0.19	2.99	u=0.509，P＜0.05
10³	6	3.30	0.11	3.33	4.48	0.35	7.81	u=0.180，P＜0.05
10⁵	6	1.12	0.09	8.04	2.04	0.31	15.20	u=0.070，P＜0.05
注：(1) 以定量检测结果的对数值log(拷贝/ml)计算。

表选项

2.3 -80 ℃保存对核酸检测的影响

对细胞株A/北京朝阳/1211/2015(H3)10～10¹³倍系列稀释后分别使用快速提取法及离心柱法提取核酸,比较提取后立即检测及提取后-80 ℃保存10 d后复测的病毒载量,结果可见两种方法-80 ℃保存后再次检测时,较立即检测所得病毒载量均有所损失,离心柱法最低检测限由10^-13升至10^-11,快速提取法最低检测限由10^-11升至10^-6。对3次平行检测的对数平均值进行分析,结果显示,快速提取法核酸损失为29.84%～97.85%,中位值为86.91%,离心柱法核酸损失量则仅为1.92%～54.15%,中位值为7.56%,快速提取法核酸损失量是离心柱法的1.5～92倍,明显大于离心柱法；且呈样本中病毒载量越低,冻融后核酸损失越大的趋势。经配对t检验,差异有统计学意义(t=-4.13,P=0.002)。见图 2。

图 2 不同浓度样本使用不同提取方法提取的核酸-80 ℃存放10 d后的影响 Figure 2 Effects of different isolation methods for different concentrations samples on RNA storage at -80 ℃ for 10 days

图选项

2.4 不同病毒载量临床样本检测结果

依据离心柱法对67份咽拭子样本的定量检测结果将样本分为不同病毒载量组,使用快速提取法提取核酸,实时荧光RT-PCR进行定性检测,结果见表 3。表明使用实时荧光RT-PCR进行定性检测咽拭子中病毒核酸时,快速提取法与离心柱法相比,阳性符合率随样本中病毒量增加而升高。当咽拭子样本中病毒量>10³拷贝/ml时,阳性符合率达100%。

表 3 快速提取法与离心柱法对不同浓度临床样本的检测结果 Table 3 Detection results of clinical samples with different concentrations by rapid extraction and spin column extraction

离心柱法检测(拷贝/ml)	快速提取法		离心柱法
离心柱法检测(拷贝/ml)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)
10～10²	10	76.92	13	100.00
10²～10³	25	92.59	27	100.00
>10³	27	100.00	27	100.00
合计	62	92.54	67	100.00

表选项

3 讨论

病毒的核酸提取方法目前主要为离心柱法及磁珠法^[5-8],其主要操作步骤均为三步：首先利用裂解液促使细胞破碎,使细胞中的核酸释放出来,然后将释放的核酸特异地吸附在特定的载体上,最后将吸附在特定载体上的核酸洗脱下来,得到纯化的核酸。离心柱法采用特殊的硅基质吸附材料吸附核酸,具有核酸纯度高、易于标准化操作、单份样本可在20 min内完成的优势,但同时存在耗费样品量较多、操作中需要反复离心,不便于高通量操作等缺陷。磁珠法则利用表面连接了可特异地可逆吸附核酸的功能基团的复合磁性微球,并利用磁珠自身的磁性,在外加磁场的作用下实现定向移动与富集来实现核酸的分离纯化,具有操作简便,高通量和自动化优势,96份样本的核酸提取在40 min内即可完成,且有研究表明其灵敏度与离心柱法相当^[9]。本研究探讨的快速提取试剂采用方法的主要操作步骤仅为裂解,即通过裂解液中的去污剂破坏病毒外壳,释放病毒核酸,并通过95 ℃加热来加速裂解过程,高效释放核酸,同时裂解液中加入核酸稳定剂,防止病毒RNA在高温和蛋白质存在的环境下被降解,从而达到提取和保存核酸的作用。全部操作仅为95 ℃加热2 min及离心2 min两个步骤,全程无需开盖,最大限度地避免了因开关样本管盖而导致交叉污染的可能,同时该方法直接裂解样本,更适用于珍贵样本的核酸提取,因此该方法具有更加简单快速、安全可靠、成本更低、效率更高的优势。与以QIAGEN公司的QIAmp viral RNA mini kit试剂盒为代表的离心柱法相比,快速提取试剂的灵敏度逊于离心柱法。对于细胞培养液、鸡胚培养液等含有纯度较高的病毒RNA样本,快速提取法检测到的病毒载量低于离心柱法10倍,而对病毒量较少的咽拭子样本,则低100倍。对于病毒载量较高的咽拭子样本,快速提取法与离心柱法虽存在定量检测差异,但定性检测结果则完全一致。当样本中病毒含量较少时,快速提取法提取的核酸会出现实时荧光PCR检测假阴性结果,这在对临床样本的检测中也得到了进一步验证。考虑其原因可能是由于快速提取法没有对样本中干扰核酸扩增检测的抑制物如脂类、蛋白等成分进行有效去除而导致。但该方法仍然不失为检测样本量大、人手不足、设备欠缺的基层实验室的一种技术选择。

对提取的核酸经-80 ℃保存10 d后复测,结果显示快速提取试剂提取的核酸最低检测限较之提取后立即检测提高了10⁵倍,而离心柱法仅提高了10²倍,其原因可能在于快速提取法提取的核酸纯度不佳,经反复冻融后,核酸降解严重所导致,因此使用快速提取法提取核酸时,及时使用效果最佳。

CV值是考查检测方法的重复性指标,本研究结果表明,当样本中病毒载量较低时,快速提取法与离心柱法提取病毒核酸的重复性均较病毒载量高时差,但快速提取法在方法的重复性上具有明显优势,表明快速提取法稳定性优于离心柱法,这可能与其操作步骤少,无需换管有关。

综上所述,快速提取试剂对含有大量分离培养后的流感病毒RNA的提取上具有较大优势,可用于流感毒株基因特性分析中的核酸提取。在应对检测流感病毒导致的暴发疫情所采集的咽拭子样本时,快速提取法具有操作简便、快速的绝对优势,但同时会有漏检风险存在,需评估后使用。

作者贡献:

石伟先：实验设计与实施,数据整理及论文撰写

张靖：文献检索与实验实施

孙瑛：数据整理与统计分析

刘医萌、潘阳、赵佳琛：实验操作

张代涛：试剂耗材订购

崔淑娟：数据库建立

彭晓旻：实验室质量控制

卢桂兰：实验操作质量控制

陈丽娟：结果分析

王全意、杨鹏：实验设计与指导

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