2016, Vol. 31扩展功能
文章信息
- 司晨琛, 李振军, 唐璐, 韦超, 吉兴照, 徐帅, 楼永良
- SI Chen-chen, LI Zhen-jun, TANG Lu, WEI Chao, JI Xing-zhao, XU Shuai, LOU Yong-liang
- secA1基因用于诺卡菌菌种鉴定分型的研究
- Identification of Nocardia species based on secA1 gene
- 疾病监测, 2016, 31(12): 1001-1006
- Disease Surveillance, 2016, 31(12): 1001-1006
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2016.12.007
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文章历史
- 收稿日期：2016-07-13
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
3. 山西医科大学, 山西 太原 030000
2. State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
3. Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi, China
诺卡菌(Nocardia)属细菌界，放线菌门，放线菌纲，放线菌目，棒状杆菌亚目，诺卡菌科，诺卡菌属，是一种广泛分布的腐生型、需氧的革兰阳性杆菌，具有G+C含量高、初代生长缓慢、机会致病的特点[1]。以表型鉴定为基础的鉴定方法耗时长、准确度低，不足以将诺卡菌准确鉴定至种水平[2]，且在新菌种的鉴定上也存在缺陷，因此，以诺卡菌基因保守片段为靶序列的核酸扩增方法为其鉴定提供了一种新的可能[3]。
近年来，随着16S rRNA基因在原核生物系统进化分析的广泛应用[3]，及其在诺卡菌菌种鉴定分型方面表现出的优越性，16S rRNA基因被作为诺卡菌菌种鉴定分型的“金标准”[4]。然而随着原核生物细菌界新菌种的发现与研究的深入，16S rRNA基因也存在两个缺点：16S rRNA基因存在多拷贝现象，降低了其鉴定的准确性与可靠性；较高的保守性和较低的进化速率使其在细菌新菌种的鉴定和分型能力方面受到限制[5-6]。因此，越来越多的管家基因被用来进行原核生物的系统进化分析，例如secA1、hsp65、gyrB、rpoB基因和16S~23S rRNA内转录间隔区(ITS)等[7-9]。
secA1基因编码SecA1蛋白[10]，是前蛋白移位酶的必要组分，能够驱动蛋白质跨过细胞质膜，是一种具有足够可变序列的单拷贝管家基因[11]，在戈登氏菌属、分枝杆菌属近缘种的鉴定中得到了良好应用[12-13]。本研究采用secA1基因对诺卡菌菌株进行鉴定与分型，旨在研究其鉴定分型能力及其临床应用的可行性。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株本实验所用16种共91株诺卡菌，其中38株诺卡菌标准株购自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen and Zellkulturen，DSMZ)，21株临床分离菌株均经传统方法并结合16S rRNA基因鉴定至菌种，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物安全实验室提供，32株诺卡菌序列下载自GenBank。菌株信息见表 1。
| 菌种类型 | 标准菌株数 | 临床菌株数 | GenBank | 总计 |
| 脓肿诺卡菌(N. abscessus) | 1 | 3 | 2 | 6 |
| 非洲诺卡菌(N. Africana) | 3 | 0 | 2 | 5 |
| 亚洲诺卡菌(N. asiatica) | 2 | 2 | 3 | 7 |
| 星形诺卡菌(N. asteroides) | 2 | 0 | 2 | 4 |
| 北京诺卡菌(N. beijingensis) | 1 | 2 | 2 | 5 |
| 巴西诺卡菌(N. brasiliensis) | 2 | 2 | 2 | 6 |
| 短链诺卡菌(N. brevicatena) | 1 | 0 | 3 | 4 |
| 肉色诺卡菌(N. carnea) | 6 | 0 | 0 | 6 |
| 盖尔森基兴诺卡菌 (N. cyriacigeorgica) |
0 | 5 | 0 | 5 |
| 鼻疽诺卡菌(N. farcinica) | 3 | 5 | 0 | 8 |
| 克鲁吉亚诺卡菌(N. kruczakiae) | 1 | 0 | 3 | 4 |
| 新星诺卡菌(N. nova) | 6 | 0 | 2 | 8 |
| 豚鼠诺卡菌(N. otitidiscaviarum) | 4 | 2 | 3 | 9 |
| 少食诺卡菌(N. paucivorans) | 1 | 0 | 2 | 3 |
| 南非诺卡菌(N. transvalensis) | 2 | 0 | 3 | 5 |
| 老兵诺卡菌(N. veterana) | 3 | 0 | 3 | 6 |
| 合计 | 38 | 21 | 32 | 91 |
包括脑心浸液培养基(brain heart infusion ager，BHI ager)(OXOID)，细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化)，Premix TaqTM酶(TaKaRa)，2000 bp DNA Ladder (TaKaRa)，GoldviewTM(北京普博欣生物科技)，梯度聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪Lab Cycler Standard plus型(德国senso)，核酸浓度测定仪NanoDorf-1000 centrifuge 5415D (NanoDorf)，电泳仪(北京东方君意公司)和凝胶成像系统GEL Doc 2000(Bio-Rad)。
1.1.3 数据库与软件美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；
1.2 方法 1.2.1 模板DNA制备根据细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化)说明书步骤操作。紫外分光光度计(260 nm)检测DNA浓度与质量。
1.2.2 secA1基因的扩增、电泳分析与测序含M13尾巴的secA1基因特异性引物序列见表 2(M13序列由黑体标识)[14-16]，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。PCR反应体系为30 μl，包括：2×Premix TaqTM(TaKaRa)15 μl，引物F、R各1 μl，模板DNA 60~150 ng，去离子水补充至30 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。
PCR扩增产物点样于混有5%核酸染料GoldviewTM的2%琼脂糖凝胶中，180 V电泳20 min，置于凝胶成像系统观察并拍照记录。将扩增成功的PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序，测序方法采用双脱氧核糖核酸末端终止法(Sanger法)；测定序列在GenBank数据库中运用BLAST程序进行比对分析。
1.2.3 secA1基因进化树的建立及序列分析采用DNAstar/Seqman程序将双向测序序列拼接成单一序列；采用Mega 6.06/Clustal W程序对测序所得的59株诺卡菌secA1基因序列及从GenBank下载的32株诺卡菌secA1基因序列进行多序列比对；采用Lasergene/MegAlign程序计算种内与种间的相似度；采用邻接法(Neighbor-Joining，N-J)构建进化树，自展检测(Bootstrap)设置为重复500次。
2 结果 2.1 secA1基因电泳59株诺卡菌secA1基因PCR扩增产物均可得到约500 bp的特异性电泳条带，与预期片段大小相符。
2.2 secA1基因序列分析使用NCBI/BLASTn程序对59株诺卡菌的secA1基因序列进行比对分析，PCR扩增片段为目的基因，secA1基因可以准确地将诺卡菌鉴定至种水平。
2.3 secA1基因种内及种间相似度分析对91株共16种诺卡菌的secA1基因序列，在软件DNAstar/MegAlign中采用Clustal W方法进行多序列比对分析，并计算种内及种间相似度水平，分析结果见表 3。诺卡菌secA1基因种内相似度水平为97.2%~100.0%，平均相似度达98.6%；其中非洲诺卡菌(N. africana)、短链诺卡菌(N. brevicatena)、少食诺卡菌(N. paucivorans)的相似度水平最高，均为100%；星形诺卡菌(N. asteroides)的种内相似度跨度最大，为97.0%~100.0%。其种间相似度为85.2%~98.4%，平均相似度达91.8%；其中新星诺卡菌(N. nova)与克鲁吉亚诺卡菌(N. kruczakiae)的种间相似度水平最高达97.5%~98.4%；北京诺卡菌(N. beijingensis)与肉色诺卡菌(N. carnea)的种间相似度水平最低达85.2%~86.8%。
| 菌种类型 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | |
| N. carnm | 1 | 97.9~100 | 86.3~87.3 | 87.3~88.9 | 86.1~87 | 88.7~88.9 | 86.6~87.7 | 86.8~89.1 | 85.2~86.8 | 86.8~87.5 | 88.4~88.7 | 88.4~89.1 | 88.4~89.4 | 87.5~88 | 88.7~89.8 | 85.9~87 | 88.7~89.4 |
| N. farcinica | 2 | 99.1~100 | 89.6~91.2 | 90.3~91 | 85.9~86.6 | 88.9~90.5 | 91.9~92.8 | 90.7~91.9 | 90~91.2 | 90.7~91.4 | 85.6~86.3 | 85.9~87 | 90.7~91.7 | 90.5~91 | 90.3~91 | 85.4~86.6 | |
| N. cyriucigeorgica | 3 | 97.2~100 | 91.9~92. 8 | 89.6~90.3 | 90~91 | 90.3~92.6 | 92.1~93.1 | 92.1~93.1 | 90.3~91.4 | 88.7~89.4 | 88~89.4 | 92.1~93.3 | 90.5~91.4 | 92.4~93. 1 | 88.9~90.3 | ||
| N. abscessiai | 4 | 99.3~100 | 88.7~89. 1 | 94.2~95.6 | 91.4~92. 1 | 95.8~96.8 | 92.4~93.3 | 90.7~91.4 | 87.7~88 | 86. 8~87. 7 | 91.9~916 | 88.7~89. 1 | 91.7~916 | 88~88.7 | |||
| N. Africana | 5 | 100 | 87.7~88.7 | 86. 8~87 | 89. 1~89.4 | 87.7~88.0 | 88.0 | 97.2~97.5 | 96.5~97. 2 | 87.7~88.2 | 88.7 | 89.4 | 91~91.2 | ||||
| N. asiatica | 6 | 97.5~100 | 88.7~90.5 | 93.3~94.7 | 89.8~91.7 | 89.4~90 | 86.6~87.3 | 85.9~87 | 89.1~90.5 | 88~88.4 | 89.8~91 | 86.3~87.5 | |||||
| N. asteroides | 7 | 97~100 | 91.2~92.4 | 89. 8~91 | 90~91.2 | 87.0~87.3 | 86.1~87 | 91.9~93.1 | 88.9~89. 8 | 90.7~92.8 | 86.6~88 | ||||||
| N. beijingensis | 8 | 97.5~100 | 92.1~93. 1 | 90~91.7 | 87.5~88.7 | 86.8~88.4 | 9 1~92.4 | 88.4~90 | 91.9~92.6 | 86.6~88.7 | |||||||
| N. hrmiliensis | 9 | 98.6~100 | 90~90.5 | 88.0~88.7 | 88.4~89.4 | 91.9~92.6 | 89.1~89.8 | 90.3~91.2 | 86.8~87.7 | ||||||||
| N. brevimtena | 10 | 100 | 87.7 | 87.5~88.2 | 91.4~91.7 | 95. 1 | 90.5~91.2 | 90.3~90.5 | |||||||||
| N. kruczakiae | 11 | 99.8~100 | 97.5~98.4 | 88~88.4 | 88.0 | 88.7~89. 1 | 91.9 | ||||||||||
| N. nova | 12 | 98.1~100 | 87.7~88.9 | 87.7~88.4 | 87.7~88.7 | 91.2~91.9 | |||||||||||
| N. otitidiscaviarum | 13 | 99. 5~100 | 90.5~90.7 | 93.8~94.4 | 88~88.7 | ||||||||||||
| N. pauciwram | 14 | 100 | 89.4~90 | 89.1~89.4 | |||||||||||||
| N. trammlensis | 15 | 97.5~100 | 88.4~90 | ||||||||||||||
| N. veterana | 16 | 99.5~100 |
对91株诺卡菌secA1基因序列采用N-J法构建系统发育进化树(图 1)。由图 1可知，整个进化树可分为5个组群，分别为groupⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ；同种诺卡菌聚集在同一进化支，16种诺卡菌分别聚集在16个不同的进化支，其中非洲诺卡菌、克鲁吉亚诺卡菌、新星诺卡菌三者亲缘关系较近。secA1基因可将诺卡菌各菌种分离开，在诺卡菌近缘种新星诺卡菌复合体、少食/短链诺卡菌复合体的分型方面表现出独特的优势。
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| 图 1 邻接法构建的secA1基因系统发育进化树 Figure 1 Phylogenetic trees based on secA1 gene sequences by neighbor-joining method 注：▲表示GenBank下载序列；◇表示临床分离菌株。 |
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诺卡菌是一种机会致病菌，能够引起人或动物的急性、慢性化脓性或肉芽肿病变[1, 17]。其肺部症状多类似于结核病[18]，但肺诺卡氏菌病的流行病学特征和治疗方法明显异于结核病[19]，因此快速准确地鉴定诺卡菌对疾病的确诊及合理用药尤为重要。
近年来，以PCR为基础的各种分子鉴定技术飞速发展[20-21]，为诺卡菌的鉴定和分型开辟了新的道路，正确选择分子靶基因是运用分子鉴定技术的基本保证。编码蛋白质基因的分子进化，主要由碱基序列的保守性决定，而遗传密码子的第3位碱基具有简并性，使得DNA序列表现多态性的同时，氨基酸序列保持稳定性。因此，编码蛋白质的基因在以种为单位的分类单元中，被认为是一种比16S rRNA基因更好的，可用于系统进化分析的分子靶标[22]。
本次研究采用编码SecA1蛋白的secA1基因对诺卡菌进行鉴定和分型，secA1基因存在足够的可变序列，Zelazny等[13]将其用于分枝杆菌属的鉴定，且纳入亲缘关系较近的戈登氏菌属、红球菌属、束村氏菌属及诺卡菌属验证其鉴定分型效果，研究发现secA1基因可用于区分29种分枝杆菌，并且对纳入研究的北京诺卡菌和巴西诺卡菌也能进行有效分离。其次，采用N-J法构建系统发育进化树，该方法基于最小进化原理，通过确定距离最近的成对分类单位，使进化树的总距离达到最小，并同时给出进化树的拓扑结构和分支长度。具有准确度高、计算速度快的优点，适用于信息位点较少、进化距离较短的分析模型，是应用最广泛的基于距离数据构建系统进化树的方法[23-24]。
对诺卡菌secA1基因测序结果的分析表明，16种诺卡菌的种内平均相似度达98.6%，提示secA1基因在诺卡菌种内保守性较高；种间平均相似度达91.8%，提示secA1基因在诺卡菌种间的进化速率较低。以结核分枝杆菌标准株H37Rv为外群建立系统发育进化树，secA1基因可以将结核分枝杆菌与诺卡菌分离开，并将整个进化树分为5个组群，其中groupⅠ涵盖的诺卡菌种类最多，包括新星诺卡菌复合体、少食/短链诺卡菌复合体、肉色诺卡菌、盖尔森基兴诺卡菌共8种诺卡菌。根据各分支的稳定性即自展值的高低，发现除新星诺卡菌和北京诺卡菌(N.beijingensis)的自展值较低，分别为73%和79%以外，其余诺卡菌菌种的自展值均≥99%，各分支的稳定性较高。
新星诺卡菌复合体包括非洲诺卡菌、克鲁吉亚诺卡菌(N. kruczakiae)、新星诺卡菌和老兵诺卡菌(N. veterana)[25]，通过表型的方法几乎不能区分，大多数情况下，16S rRNA基因虽然可以将其准确鉴定，但分型效果较差，不能将该复合体中的诺卡菌菌种分离为不同的群[3, 26]。secA1基因在新星诺卡菌复合体中也表现出相对较高的种间相似度水平，其中老兵诺卡菌与复合体中其他的菌种的种间相似度水平不高于91.9%，分离度最高，在进化树上距离较远；克鲁吉亚诺卡菌与新星诺卡菌的种间相似度最高，表现为97.5%~98.4%，分离度最低，但在系统发育进化树上仍可以被分离在不同的进化支上。短链诺卡菌(N. brevicatena)与少食诺卡菌(N. paucivorans)属于另一诺卡菌复合体[25]，其种内与种间相似度分别为100.0%和95.1%，在进化树上被分为两支独立的进化支，分离度较高。
本研究分析了国外的诺卡菌标准菌株，更重要的是纳入了7种国内收集的诺卡菌临床分离菌株，丰富了样本来源。与此同时，从GenBank数据库下载了13种共32株诺卡菌secA1基因序列进行补充，扩大了样本量。对本科室收录的91株诺卡菌菌株的聚类分析发现，在系统发育进化树上16种诺卡菌被准确分离为16个独立的分支，诺卡菌近缘种新星诺卡菌复合体、少食/短链诺卡菌复合体均可有效分离，且国内收集的临床分离菌株与相应的国外标准菌株被聚集在同一分支，在一定程度上显示出其临床应用的可行性。
综上所述，secA1基因对诺卡菌属可进行较好的鉴定和分型，尤其在诺卡菌复合体的分型方面有独特的优势。但是诺卡菌的低发病率限制了本科室收集临床标本的数量及种类，有待扩大样本量及样本种类进一步的研究验证。故secA1基因在临床应用中可以联合16S rRNA基因，在确保鉴定准确性的同时，也弥补16S rRNA基因在诺卡菌复合体分型上的缺陷。
作者贡献:
司晨琛 ORCID：0000-0002-9794-2701
司晨琛：设计实验思路，负责主要实验工作并撰写本文
吉兴照，唐璐，韦超，徐帅：负责部分实验工作
李振军：提供课题经费，并参与文章的修改
楼永良：指导文章的思路，并参与文章的修改
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