2017, Vol. 32扩展功能
文章信息
- 盖晶, 吴健, 王绪琴, 宿飞, 陶静, 郁晓磊, 郑敏, 周艳秋, 周鑫, 薛以乐, 康来仪
- GAI Jing, WU Jian, WANG Xu-qin, SU Fei, TAO Jing, YU Xiao-lei, ZHENG Min, ZHOU Yan-qiu, ZHOU Xin, XUE Yi-le, KANG Lai-yi
- 上海地区艾滋病病毒感染者/艾滋病患者原发性耐药基因调查及抗病毒治疗效果观察
- Observation of HIV primary drug resistance effect of highly active antiretroviral therapy in Shanghai
- 疾病监测, 2017, 32(2): 162-167
- Disease Surveillance, 2017, 32(2): 162-167
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.02.019
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文章历史
- 收稿日期：2016-07-22
2. 上海市黄浦区疾病预防控制中心, 上海 200023;
3. 上海市虹口区疾病预防控制中心, 上海 200082;
4. 上海市长宁区疾病预防控制中心, 上海 200051;
5. 上海市静安区疾病预防控制中心, 上海 200041
2. Huangpu District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200023, China;
3. Hongkou District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200082, China;
4. Changning District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200051, China;
5. Jing'an District Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200041, China
自1996年全球开展高效抗反转录病毒治疗 (highly active antiretroviral therapy，HAART) 以来，艾滋病病毒感染者/艾滋病患者 (HIV/AIDS) 的发病率和病死率已大幅度降低，但却导致HIV耐药毒株逐渐增加且向普通人群传播。据报道，欧美等国家原发耐药的发生率已达20%以上。HIV耐药是抗病毒治疗失败的重要原因之一，是目前抗病毒治疗面临的重大难题[1]。由于抗HIV需要终生服药，因此分析和评估中长期的HAART资料更具临床价值。本研究对上海市2007-2013年HIV-1感染者中的原发性耐药病例进行HAART随访观察研究，观察HIV耐药对抗病毒治疗效果的影响，为调整长期治疗策略提供依据。
1 资料与方法 1.1 样本选择选取2007-2013年期间由上海市、区县疾病预防控制中心 (CDC) 确诊并在首次治疗前均未接受HAART的HIV-l感染者，在治疗资料库收集数据和相应的冻存血浆。将标本按传播途径分类，依照病例发现时间顺序对不同传播途径的病例分年度选取标本，抽样比例约为10%。
伴有原发性耐药病例的入选标准：①确诊为HIV阳性；②年龄超过18周岁；③从未接受过抗病毒治疗；④有基线T淋巴细胞CD4 +计数测定。排除标准：治疗前没有进行基线T淋巴细胞CD4+计数测定的患者。
1.2 病例随访研究对象入组队列及随访过程均按照《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》中的要求接受流行病学调查以了解人口学特征、HIV感染史、抗病毒治疗史、临床症状和体征、CD4+T淋巴细胞计数等相关实验室检测。所有患者均按国家免费抗病毒治疗的随访流程进行，1 543例患者随访时间为治疗开始后的0.5个月、1个月、2个月、3个月，以后每3个月随访一次。随访内容包括有无漏服药或服药错误、CD4+T淋巴细胞计数、病毒载量等。共开展了1 543例患者标本的耐药检测，对其中32例伴有原发性耐药的感染者进行为期1~7年的抗病毒治疗效果随访。
1.3 实验室检测 1.3.1 RNA模板提取及测序取血浆200 μl，使用RNA提取试剂盒 (QIAcube HT Kit及QIAcube HT Plasticware，德国QIAGEN公司产品) 进行RNA模板提取及基因扩增。获得RNA后通过反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 和巢式PCR扩增HIV-1 pol区的蛋白酶 (protease inhibitor，PR) 基因区和部分反转录酶 (reverse transcriptase，RT) 基因区，其引物序列见表 1，PCR反应条件见文献[2]。使用毛细管电泳仪QIAxcel DNA及QIAxcel DNA Screening Kit扩增片段，获得的PCR扩增产物片段约3.1 kb。PCR扩增产物由上海欧易生物技术有限公司纯化并进行双向测序，测序引物见表 1。
| 引物名称 | 引物序列 (5′~3′) | 位置 (HXB2) | 方向 |
| Pol-1e | TGG AAA TGT GGA (G) AA G (A) G AA (G) GGA C | 2 029→ 2 050 | 外侧上游 |
| Pol-x | CCT GTA TGC AG (A) A (C) C CCC AAT ATG TT | 5 241→ 5 265 | 外侧下游 |
| Pol-3(1) | ACT GAG AGA CAG GCT AA TTT TTT AGG GA | 2 068→ 2 095 | 内侧上游 |
| Pol-4e(1) | CTC CTA GTG GGA TRT GTA CTT CYG ARC TTA | 5 221→ 5 192 | 内侧下游 |
| 注：(1) 为测序引物。 | |||
使用Squencer 4.9等软件进行序列的排列、比对和编辑，应用美国斯坦福大学HIV耐药数据库Version 7.0(http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra) 进行耐药性分析。
1.3.3 病毒载量检测采用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test version 2.0试剂盒 (TaqMan实时定量PCR-荧光法，美国Roche公司)，使用仪器为Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan全自动分析系统 (美国Roche公司)，有效线性检测范围为20~1.0 ×107 HIV RNA拷贝/ml， < 20 HIV RNA拷贝/ml为阴性。操作严格按照试剂盒和仪器说明书进行。
1.4 抗病毒治疗依从性调查本研究设计了服药依从性指标评估问卷 (CASE问卷)[3]，通过简单的3个问题和简易的打分系统，快速对患者近期服药依从性做出评估。指标打分标准： > 10分表示依从性好；≤10分表示依从性差。患者所用药物包括齐多夫定 (AZT)、司他夫定 (D4T)、奈韦拉平 (NVP)、拉米夫定 (3TC)、依非韦伦 (EFV)、洛匹那韦利托那韦片 (克力芝，KLC)、替诺福韦 (TDF) 等均为国家免费提供，药品从上海市公共卫生临床中心领取。采用国家标准抗病毒治疗一线或二线方案。每种方案均包含3种抗病毒治疗药物。一线方案包括2种核苷类反转录酶抑制药和1种非核苷类反转录酶抑制药。
1.5 统计学分析所有数据均采用SPSS 12.0软件建立数据库并进行分析。采用Fisher确切概率法对资料进行检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 抗病毒治疗依从性对2012年新发现的274例HIV/AIDS开展的服药依从性调查显示，除2例患者在最近1周内因工作原因有过1次不按时服药的现象外，其余均严格按照要求服药，没有漏服。对2012年病毒抑制情况分析时，有11例回原户籍所在地治疗，死亡3例，未能配合完成检测13例，仅247例患者参与病毒抑制情况调查。随访至2013年，有32例被调查者失访，其中有13例回原户籍所在地治疗，死亡2例，流动至其他省市11例，不愿继续参与监测6例。随访1年的病毒抑制情况显示，CD4+检测平均值由228.0/μl上升至344.2/μl (P < 0.001)，CD4+>350/μl人数比例由54.2%上升至92.7%(P < 0.001)。除3例患者病毒载量 > 1 000 copies/ml外，其余均小于检测下限。病毒载量≥1 000 copies/ml的患者比例从2012年的99.2%下降至2013年的1.4%(P < 0.001)，见表 2。
| 年份 | 观察人数 | 病毒载量 (拷贝/ml) | CD4+(/μl) | |||||||
| ≥1 000 | < 1 000 | x | >350 | |||||||
| 例数 | 百分比 (%) | 例数 | 百分比 (%) | 例数 | 百分比 (%) | |||||
| 2012 | 247 | 245 | 99.2 | 2 | 0.8 | 228.0 | 133 | 54.2 | ||
| 2013 | 215 | 3 | 1.4 | 212 | 98.6 | 344.2 | 199 | 92.7 | ||
32例患者耐药突变中，有RT耐药突变共21例，其中对核苷类反转录酶抑制剂 (nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTI) 的主要耐药突变有7例，对非核苷类反转录酶抑制剂 (non nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTI) 的主要耐药突变有11例，对NRTIs和NNRTIs同时耐药突变有3例。蛋白酶抑制剂 (protease inhibitor，PI) 耐药突变共6例，RT区和PI区同时耐药突变共3例。整合酶 (integrase，IN) 耐药突变共2例，见表 3。
| 区型 | 突变类型 | 耐药 | 突变位点 | 例数 |
| RT区耐药 | 对NRTIs的主要耐药突变 | AZT、D4T低度耐药 | D67DN | 1 |
| ABC、DDI、TDF、AZT、D4T低度耐药 | L210W | 1 | ||
| AZT、D4T低度耐药 | L210W | 1 | ||
| AZT、D4T、低度耐药和TDF潜在耐药 | L210W、V90I | 1 | ||
| DDI高度耐药 | L74LV | 1 | ||
| ABC、DDI、TDF潜在耐药，AZT和D4T低度耐药 | T215L | 1 | ||
| 3TC、FTC潜在耐药和ABC、D4T、DDI、TDF低度耐药 | T69N, K70EK | 1 | ||
| 对NNRTIs的主要耐药突变 | EFV、NVP中度耐药 | P225H | 3 | |
| EFV中度耐药和NVP高度耐药 | K238T | 2 | ||
| RPV中度耐药 | E138K、V179D | 1 | ||
| NVP中度耐药 | F227FL | 1 | ||
| EFV、NVP高度耐药和ETR、RPV中度耐药 | G190E | 1 | ||
| EFV、ETR潜在耐药和NVP、RPV中度耐药 | K101E | 1 | ||
| EFV、ETR潜在耐药和NVP、RPV中度耐药 | K101EK | 1 | ||
| EFV、NVP中度耐药 | V179E | 1 | ||
| 对NRTIs和NNRTIs同时耐药突变 | ABC低度耐药、DDI中度耐药和EFV、ETR、NVP、PRV潜在耐药 | L74IL，V179D | 1 | |
| AZT、D4T、EFV潜在耐药和NVP低度耐药 | N348I | 1 | ||
| DDI潜在耐药、EFV、ETR、RPV中度耐药、NVP高度耐药 | T69NT、Y181CY | 1 | ||
| PI区耐药 | NFV低度耐药 | T74S | 2 | |
| NFV低度耐药 | L10I | 1 | ||
| SQV/r高度耐药，ATV/r、NFV中度耐药，IDV/r、LPV/r、TPV/r低度耐药，FPV/r潜在耐药 | G48V、I50D、I54 insertion | 1 | ||
| NFV高度耐药 | D30DN | 1 | ||
| TPV/ r中度耐药 | V82L、I 84L | 1 | ||
| RT区和PI区同时耐药突变 | NFV、EFV、ETR、NVP、RPV潜在耐药 | L10I、K20I、I50IM、V179D | 1 | |
| FPV/r、NFV、TDF潜在耐药和AZT、D4T低度耐药 | L10F、L210W | 1 | ||
| ABC、DDI潜在耐药，ATV/r、FPV/r、LPV/r、ETR、AZT、D4T低度耐药，IDV/r、SQV/r中度耐药，NFV、EFV、NVP、RPV高度耐药 | L90M、L10I、A71T、T215S和Y188L | 1 | ||
| IN区耐药 | EVG潜在耐药和RAL高度耐药 | Y143H | 1 | |
| EVG高度耐药和RAL中度耐药 | E92Q，L74M | 1 |
2007-2013年共发现HIV感染者和AIDS患者伴有原发性耐药病例42例，其中剔除失访8例，死亡1例，停药1例，接受HAART的艾滋病患者32例，2007年11月至2014年8月陆续开始抗病毒治疗，定期随访至2015年11月31日。每年治疗的人数为2007年1例 (3.1%)，2008年5例 (15.6%)，2009年4例 (12.5%)，2010年8例 (25.0%)，2011年7例 (21.9%)，2012年8例 (25.0%)，2013年14例 (43.8%)，2014年1例 (3.1%)，均为以前未使用过抗病毒药物的初次治疗成人患者，年龄19~63岁，年龄中位数34岁，平均 (36.3±11.9) 岁。其中男性31例 (96.9%)，本市户籍17例 (53.1%)，未婚18例 (56.3%)，同性传播24例 (75.0%)。
2.4 治疗方案更换情况32例耐药突变病例中，有11例因副反应更换了治疗方案，其中7例更换了一线方案中的个别药物，另4例更换为二线方案药物。
2.5 抗病毒治疗前后淋巴细胞和病毒载量检测情况对患者治疗前后的CD4+T淋巴细胞变化进行分析。除治疗6年以上的患者外，其他CD4+细胞计数明显上升，并随着时间递增，治疗0.5、1、2、3、4和5年后CD4+细胞计数水平明显高于治疗前 (χ2=29.143，P < 0.05)。32例患者每年检测病毒载量，除了2例患者在治疗第1年时病毒载量为600拷贝/ml和700拷贝/ml外，其余病毒载量检测均低于检测下限，病毒抑制率为100%，见表 4。
| 治疗时间 (年) | 累计例数 | CD4+T淋巴细胞计数水平 (/ μl) | 病毒载量 (拷贝/ml) | |||||
| x±s | < 100 | 100~ | 200~ | > 350 | < LDL | |||
| 7 | 2 | 432.0±100.4 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | |
| 6 | 5 | 454.0±66.8 | 0 | 0 | 1 | 4 | 5 | |
| 5 | 9 | 458.2±202.4 | 0 | 0 | 4 | 5 | 9 | |
| 4 | 10 | 453.2±168.5 | 0 | 1 | 2 | 7 | 10 | |
| 3 | 16 | 455.4±256.8 | 0 | 1 | 4 | 11 | 16 | |
| 2 | 23 | 441.4±245.7 | 0 | 2 | 5 | 16 | 23 | |
| 1 | 31 | 356.3±206.4 | 1 | 8 | 10 | 12 | 29 | |
| 0.5 | 32 | 304.9±188.7 | 4 | 7 | 11 | 10 | -(2) | |
| 治疗前 | 32 | 249.5±157.4 | 4 | 10 | 11 | 7 | 0 | |
| 注：(1) 本研究病毒载量检测周期为1年。(2) 表示未做病毒载量检测。 | ||||||||
艾滋病免费抗病毒治疗自2004年我国逐步推广以来，在降低艾滋病病死率、遏制HIV流行、提高HIV/AIDS生存时间及质量等方面发挥了重要作用。我国接受HAART治疗的艾滋病感染者数不断增加，截至2014年底，接受免费抗病毒治疗的HIV/AIDS累计达368 449例，有效地遏制了艾滋病疫情的发展[4]。上海市自2005年启动HARRT以来，治疗病例数逐年增加，截至2014年底上海市已累计治疗HIV/AIDS 4 800余例，基线治疗方案与国家方案一致[5-6]。随着HIV传播率上升和传播范围的扩大以及免费抗病毒治疗的持续开展，HIV原发性耐药的发生不可避免。原发耐药变异是HIV耐药株在人群中传播的直接证据，其影响患者接受HARRT治疗后对药物的敏感程度。因此，开展原发性耐药的研究，对掌握和揭示HIV耐药毒株在本地区的流行情况和流行规律，选择和制定适合本地区的治疗和控制HIV流行的方案十分重要。
本研究发现，上海市HIV-1原发性耐药率为2.7%，耐药率较低，低于文献报道的全球和全国平均水平，也低于国内其他省市的报道，但与上海市以往的报道接近或持平[7-14]。在原发性耐药发生率低于5%的耐药低流行地区，少数患者在未抗病毒治疗前会出现原发性的耐药。一旦发生针对一线治疗药物的耐药，依据本研究一线治疗效果的观察，即使治疗方案包括一种原发性耐药药物，其治疗结果与无原发性耐药者也无明显差异。因此，在原发性耐药低流行地区，只要治疗管理规范和患者服药依从性好，即使发生了对一线药物耐药的情况，仍可以继续使用该药物用于治疗。
32例HIV原发性耐药患者经HARRT治疗后，患者体内病毒得到持续抑制，CD4+细胞计数上升明显，说明随着治疗时间的延长，抗病毒治疗的效果仍然较好，CD4+细胞计数 < 200/μl所占比例减小，特别是细胞计数 < 100/μl出现了较快的下降; 细胞计数 > 200/μl所占比例则明显增长，细胞计数200~350/μl也有较快增长。在多项HARRT效果影响的研究表明，不耐药组临床症状明显轻于耐药组，病情缓解率明显高于耐药组，病毒载量也明显低于耐药组.两组患者的CD4+T淋巴细胞数的差异无统计学意义[15-16]。
目前所用的一线药物或二线药物在本研究中所有HIV原发性耐药的患者仍然有效，患者的免疫功能重建效果能表现出明显的优势。本研究显示，在原发性耐药率低流行地区，如果治疗管理规范，患者服药医从性好，并经常开展公共卫生原发性耐药监测，在条件有限的情况下可不考虑进行治疗前原发性耐药检测。但我国地域辽阔，社会经济发展差异性较大，尚需在实践中进一步扩大理论研究，尤其是原发性耐药高流行地区是否需要在治疗前进行耐药检测仍应进一步开展相关研究。需要指出的是，从公共卫生角度定期开展HIV原发性耐药监测仍是必需的，掌握本地区耐药演变趋势，指导治疗对策，也是预防抗病毒治疗失败及合理选择治疗方案的重要手段。
作者贡献:
盖晶 ORCID：0000-0003-1877-5798
吴健 ORCID：0000-0001-7969-4698
盖晶、吴健：主要负责写作，实验安排，数据分析等工作
王绪琴、宿飞、陶静、郁晓磊、郑敏、周艳秋、周鑫：负责实验操作，数据统计，资料整理等
薛以乐、康来仪：对研究设计和文章撰写进行指导
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