2017, Vol. 32扩展功能
文章信息
- 黄业伟, 吴冰珊, 陈凤钦, 黄枝妙, 翁育伟, 严延生
- HUANG Ye-wei, WU Bing-shan, CHEN Feng-qin, HUANG Zhi-miao, WENG Yu-wei, YAN Yan-sheng
- 2009-2015年福建省福州市急性腹泻儿童中诺如病毒基因多样性及动态变化研究
- Genetic diversity and its dynamic variation of noroviruses causing acute diarrhea in children in Fuzhou, 2009-2015
- 疾病监测, 2017, 32(3): 216-221
- Disease Surveillance, 2017, 32(3): 216-221
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.03.012
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文章历史
- 收稿日期：2016-11-01
2. 福建省疾病预防控制中心, 福建 福州 350001;
3. 福建省人兽共患病重点实验室, 福建 福州 350001;
4. 福州市儿童医院, 福建 福州 350001
2. Fujian Center for Disease Control and Prvention, Fuzhou 350001, Fujian, China;
3. Fujian Provincial Priority Laboratory for Zoonoses, Fuzhou 350001, Fujian, China;
4. Children's Hospital of Fuzhou, Fuzhou 350001, Fujian, China
诺如病毒 (Norovirus，NV) 又称诺瓦克病毒，最早是由Kapikian等[1]在1972年对1968年美国诺瓦克地区的一所学校的胃肠炎暴发疫情患者的粪便通过免疫电镜检测时发现。NV是引起儿童和成年急性非细菌性胃肠炎的主要病原体之一，全世界18%的腹泻性疾病与NV感染有关，每年约21.20万人死亡[2]。自2006年在中国17个省份建立病毒性腹泻监测网络以来，我国目前最常见的NV为CⅡ和CⅠ型，其中NV感染率从2007年的11.20%上升至2011年的20.30%，2012年为15.30%[3]。近年来，NV感染在国内呈现逐渐上升的趋势，已经成为影响公众健康的重要公共卫生问题。
为了解福建省福州市2009-2015年期间急性腹泻儿童中NV的型别分布情况以及其动态变化趋势，本研究收集了2009-2015年福建省福州市哨点医院中急性腹泻5岁以下住院儿童样本，运用完整的VP1区和部分RdRp区基因序列对NV的型别进行分析[4]。由于双基因分型方法可以提供更为精细的病毒遗传信息，因此，可以更为准确地了解NV的流行特征，同时也为今后NV感染防控提供更可靠的依据。
1 材料与方法 1.1 标本来源及处理福建省福州市儿童医院为福州市唯一一家儿童急性腹泻监测哨点医院。本研究从该院2009 2015年间采集并经反转录聚合酶链反应 (reverse transcription-ploymerase chain reaction，RT-PCR) 筛查为NV核酸阳性的459份5岁以下急性腹泻儿童病例粪便标本中，随机抽取93份 (20.26%) 标本作为此次调查的样本。腹泻病例定义：排便≥3次/24 h且伴有形状改变 (如稀水便、水样便等) 的5岁以下儿童患者。
10%粪便悬液的制备：取100 μl粪便标本 (固体取豌豆大小) 加到1.5 ml EP管中，加入900 μl的pH 7.2的PBS (10 mmol/L) 缓冲液，振荡3次，每次10 s。然后静置10 min，再以8 000 r/min离心5 min，吸取上清进行下一步试验或-20 ℃短期保存。
1.2 试剂本研究使用的病毒RNA提取试剂盒购于苏州天隆生物科技有限公司，AgPath-IDTM One-Step RT-PCR试剂购自Applied Biosystems公司，PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒和Ex Taq DNA聚合酶购自宝生物大连有限公司 (TaKaRa)。引物合成及测序由上海铂尚生物有限公司完成。
1.3 病毒RNA提取根据试剂盒说明书操作，所得RNA置于无核酸酶离心管中，-80 ℃保存。
1.4 Real-time PCR应用表 1中所列引物和探针，使用AgPath-IDTM One-Step RT-PCR试剂盒同时检测GⅠ和GⅡ型NV。其中GⅠ型检测反应体系 (25 μl) 包含10 μmol/L的Cog 1F/Cog 1R各1 μl、10 μmol/L的Ring 1A/Ring 1B各0.3 μl、1 μl的25×RT-PCR Enzyme Mix、12.5 μl的2×RT-PCR Buffer、6.4 μl的双蒸馏水、2.5 μl的RNA。GⅡ型反应体系 (25 μl) 包含10 μmol/L的Cog 2F/Cog 2R各1 μl、0.3 μl的Ring 2(10 μmol/L)、1 μl的25×RT-PCR Enzyme Mix、12.5 μl的2×RT-PCR Buffer、6.7 μl的双蒸馏水、2.5 μl的RNA。条件为45 ℃ 10 min反转录，95 ℃ 10 min退火，45个扩增循环包含94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s。Ct值≤40判定为诺如病毒阳性。试验在7500 Real time PCR仪器 (Applied Biosystems) 上进行。
| 序号(1) | 引物/探针 | 引物序列 (5′~3′) | 方向 | 位置 (bp)(2) |
| 1 | Cog 1F | CGY TGG ATG CGⅠ TTY CAT GA | + | 5 291~5 310 |
| 2 | Cog 1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | - | 5 354~5 375 |
| 3 | Ring 1A | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-TAMRA | + | 5 321~5 340 |
| 4 | Ring 1B | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-TAMRA | + | 5 321~5 340 |
| 5 | Cog 2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | + | 5 003~5 028 |
| 6 | Cog 2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | - | 5 080~5 100 |
| 7 | Ring 2 | JOE-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-TAMRA | + | 5 048~5 067 |
| 8 | P290 | GAT TAC TCC AGG TGG GA | + | 4 568~4 584 |
| 9 | P289 | TGA CGA TTT CAT CAT CMC CRT A | - | 4 865~4 886 |
| 10 | JV12 | ATA CCA CTA TGT GCA GAT TA | + | 4 552~4 572 |
| 11 | JV13 | TCA TCA TCA CCA TAG AAA GAG | - | 4 858~4 878 |
| 12 | G2SKF | CNT GGG AGG GCG ATC GCA A | + | 5 046~5 064 |
| 13 | NV4594S | YTC YTT CTA TGG YGA TGA TGA | + | 4 585~4 605 |
| 14 | GⅡ-F1M | GGA GGG CGA TCG CAA TC | + | 5 050~5 066 |
| 15 | GV132 | CCR GCR AAG AAA GCT CCA GCC AT | - | 6 692~6 714 |
| 16 | TX30SXN(3) | GAC TAG TTC TAG ATC GCG AGC GGC CGC CC (T)30 | - | / |
| 注：(1)1~7引物/探针用于Real-time PCR，8~16引物用于常规RT-PCR；(2) 引物探针定位基于Norwalk (GⅠ) (accession No. M87661) 和Lordsdale (GⅡ) (accession No. X86557) 基因组；(3) TX30SXN为反转录反向引物。 | ||||
引物序列见表 1，NV cDNA的合成的反应体系 (10 μl) 包含5 μl 10 μmol/L的随机引物或TX30SXN引物、1 μl的dNTP (10 μmol/L)、5 μl的RNA、3 μl的双蒸馏水。置于PCR仪65 ℃ 5 min，迅速置于冰上2 min。在向上述变性的反应液中加入4 μl的5×PrimeScript Buffer、20 U的RNase Inhibitor、200 U的PrimeScript RTase。缓慢混匀，置于PCR仪中按照42 ℃ 55 min、70 ℃ 15 min的程序进行反转录反应。上述使用TX30SXN引物反转录后获得的cDNA用于完整的VP1区扩增及测序，同时将所有得到的cDNA于-20 ℃保存。
1.5.2 部分RdRp区扩增及测序取2.5 μl由随机引物获得的cDNA于含有0.5 μl (5 U/μl) 的Ex Taq、5 μl的10×Ex Taq Buffer、4 μl的dNTP (各2.5 μmol/L)、10 μmol/L的JV12/JV13各2 μl、34 μl的双蒸馏水的50 μl的反应体系中。按94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、46 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min做RT-PCR。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳观察结果，阳性标本送上海铂尚生物技术公司测序，其中阴性标本改用P289/P290引物扩增，条件同上，阳性结果送测序。
1.5.3 完整VP1区扩增及测序取2.5 μl TX30SXN反转录后获得的cDNA于含有0.5 μl (5 U/μl) 的Ex Taq、5 μl的10×Ex Taq Buffer、4 μl的dNTP (各2.5 μmol/L)、10 μmol/L的NV4594S/TX30SXN各2 μl、34 μl的双蒸馏水的50 μl的反应体系中。按94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，40个循环；72 ℃ 10 min做RT-PCR。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果，阳性标本送上海铂尚生物有限公司测序，其中阴性标本使用G2SKF/TX30SXN或GⅡ-F1M/GV132引物扩增，条件同上，阳性结果送测序。
1.6 系统进化分析通过MEGA 6.06的ClustalW进行核苷酸序列比对分析，并使用Neighbor-Joining构建系统进化树。利用BioEdit7.0.1软件进行核苷酸序列同源性分析，同时通过NV在线分型工具 (http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool) 判断其型别，并与通过种系进化分析确定的型别进行比较。
2 结果 2.1 NV检测情况2009-2015年共从福建省福州市儿童医院收集到合格标本1 938份，按照中国疾病预防控制中心《全国病毒性腹泻监测方案 (2007年修订版)》，共检出阳性标本459份 (23.68%)，各年的NV检出情况见表 2，不同年份NV核酸阳性率之间差异有统计学差异 (χ2=74.864，P < 0.001)。
| 年份 | 采样数 | NV 阳性数(1) |
NV检出率(1) (%) |
抽样数 | VP1区 阳性数(2) |
| 2009 | 217 | 63 | 29.03 | 15 | 12 |
| 2010 | 355 | 43 | 12.11 | 12 | 10 |
| 2011 | 279 | 87 | 31.18 | 17 | 14 |
| 2012 | 330 | 118 | 35.76 | 25 | 16 |
| 2013 | 238 | 55 | 23.11 | 11 | 10 |
| 2014 | 166 | 32 | 19.28 | 3 | 3 |
| 2015 | 353 | 61 | 17.88 | 10 | 8 |
| 合计 | 1 938 | 459 | 23.68 | 93 | 73 |
| 注：(1) 诺如病毒 (NV) 检测方法采用中国疾病预防控制中心《全国病毒性腹泻监测方案 (2007年修订版)》提供的方案；(2) 应用本研究的RT-PCR法扩增VP1区阳性数。 | |||||
在随机抽取的93份样品中，检出GⅡ型91份 (97.85%)，GⅡ型阳性标本中有5份 (5.49%) 为GⅠ型混合感染，未检出单独GⅠ型标本。
2.3 序列扩增及基因分型在91份GⅡ型样本中，73份 (80.22%) 完整VP1区基因序列，其中获得72份 (98.63%) 相应标本的部分RdRp区基因序列，在线基因分型工具判定的基因型别分布见表 3。
| 年份 | 完整VP1区 | 部分RdRp区 | 毒株数 |
| 2009-2010 | GⅡ.4 2006b | GⅡ.P4 2006b | 16 |
| GⅡ.3 | GⅡ.P12 | 3 | |
| GⅡ.4 New Orleans_2009 | GⅡ.P4_2006b | 1 | |
| GⅡ.3 | GⅡ.P21 | 1 | |
| GⅡ.4_2006b | GⅠ.Pa | 1 | |
| 2011-2012 | GⅡ.4_2006b | GⅡ.P4_2006b | 25 |
| GⅡ.3 | GⅡ.P12 | 2 | |
| GⅡ.4_2006b | GⅡ.P12 | 1 | |
| GⅡ.4 New Orleans_2009 | GⅡ.P4_2006b | 1 | |
| GⅡ.12 | NA(1) | 1 | |
| 2013-2015 | GⅡ.4 Syndeny_2012 | GⅡ.Pe | 16 |
| GⅡ.7 | GⅡ.P7 | 1 | |
| GⅡ.3 | GⅡ.P12 | 4 | |
| 合计 | - | - | 73 |
| 注：(1) NA为未获得部分RdRp区基因序列。 | |||
基于完整VP1基因序列的系统进化分析结果显示，73份样本中，通过构建系统进化树，GⅡ.3为10份，GⅡ.4 New Olreans_2009为2份，GⅡ.4 Syndeny_2012为16份，GⅡ.4_2006b为43份，各型病毒高度相似，其氨基酸序列差异分别为96.70%~100.00%、99.81%、98.70%~100.00%、98.15%~100.00%；与参考株之间的差异分别为95.44%~98.91%、95.74%~99.81%、97.70%~99.63%和97.59%~99.81%。另检出GⅡ.12和GⅡ.7型各1份，其与参考毒株的氨基酸差异分别为96.45%~98.50%和98.15%~99.26%，见图 1。系统进化分析与在线分型工具所得的结果一致。
基于部分RdRp基因序列的系统进化分析结果显示，72份样本部分RdRp区序列中，有43份为GII.P4_2006b变异株，16份为GII.Pe亚型，10份为GII.P12亚型，1份为GI.Pa亚型，1份为GII.P21亚型，1份为GII.P7亚型。
毒株间的遗传重组是NV病毒的常见现象，但结合两种分型方法结果可以发现，2009 2015年福建省福州市5岁以下急性腹泻住院儿童中的NV遗传相对稳定，除了个别毒株外，未发现有广泛的重组现象。如GII.4_2006b型，除GI.Pa/GII.4_2006b (1株) 外，本次调查对象中携带的主要为GII.P4/GII.4_2006b (42株)，类似的，GII.4 Syndeny_2012的RdRp型别均为GII.Pe, GII.3的RdRp型别均为GII.P12(除1株GII.P21/GII.3外)。
3 讨论NV是引起急性胃肠炎暴发的非细菌性主要病原体之一，根据其位于VP1区中的氨基酸序列差异可将其分为至少7个基因组 (GⅠ~Ⅶ)，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ型可感染人类而致病。由于NV传染性强及感染剂量低，并且能够在相对狭小的密闭空间迅速传播。近年来，NV引起的各种急性腹泻暴发疫情时有报道，应引起关注。NV的型别多样，且不同型别引起的流行强度及疾病负担各异，所以对NV的流行及病毒变异的监测尤为重要，是后续制定防治策略的重要基础。本次研究选取2009 2015年病毒性腹泻监测系统中的NV阳性标本来研究福建省福州市NV型别多样性及其型别动态变化情况。
在93份NV核酸阳性标本中，通过Real-time PCR法只检出91份NV GⅡ型。这可能与NV型别多样、标本保存时间较长以及检测方法的敏感性不同等因素有关。应用本研究的引物和RT-PCR方法，从91份阳性标本获得73份完整的VP1区和72份部分RdRp区基因序列，占阳性标本的80.22%(VP1)。上述标本的结果可以初步地描述2009 2015年福建省福州市5岁以下儿童NV感染性腹泻的型别动态变化。
本次基于病毒VP1/RdRp序列的研究结果表明，2009 2015年福建省福州市诺如病毒均为GII型，但其基因亚型多样，包括GII.P12/GII.3、GII.P21/GII.3、GII.P7/GII.7、GII.P12/GII.12、GI.Pa/GII.4_2006b、GII.P4_2006b/GII.4_2006b、GII.P12/GII.4_2006b、GII.P4_2006b/GII.4 New Orleans_2009、GII.Pe/GII.4 Sydeny_2012、GII.P12/GII.4 Sydeny_2012在内的毒株均有发现。其中尤以GII.4亚型为多，占83.4%(61/73)。该基因亚型NV常引起世界大流行，一般每隔2~3年出现一个新的流行株[5]。本研究发现，GII.P4_2006b/GII.4_2006b为2009 2012年福建省福州市5岁以下急性腹泻住院儿童中主要的流行株，该型别是在2006年替代Hunter GII.4变异毒株成为世界大流行的新变异毒株[6-7]。与GII.4 Sydney2012型别相对应的RdRp型别主要是GII.Pe[8]，该型别为2013 2015年福建省福州市5岁以下急性腹泻住院儿童中主要的流行型别，该型别是2012年3月首先在澳大利亚的悉尼发现[9]，之后广泛流行于上海、中国香港、日本等地[10-12]。GII.P12/GII.3毒株在2009 2015年均有发现，因此该型别可能在福建省福州市持续流行，这与GII.P12/GII.3毒株在2011-2014年重庆市持续流行的结果相似[13-14]。
不同型别NV之间可能发生重组，该机制导致NV型别更为复杂多样[15]。不同NV之间的重组可能导致感染力、毒力和致病力增强的变异株，造成世界大流行。本研究发现的GI.Pa/GII.4_2006b、GII.P12/GII.4_2006b和GII.P4_2006b/GII.4New Orleans_2009型别则为国内首次报道。值得注意的是，自2014年以来，浙江、广东等省相继在暴发疫情和散发病例中检出NV GII.17变异毒株，并成为2015年NV感染性腹泻中主要的流行毒株[16-17]。在此次调查中，福建省福州市并没有发现该型NV，虽然在福建省其他地区的暴发疫情中时有检出，但并没有成为流行的主要型别，这可能是由于该型病毒并没有形成能稳定流行的感染力又或是由于监测范围较小以致没有检出。由于新型NV的出现，可能导致NV相关性腹泻流行增强或临床表现加重，因此，有必要加强对NV的病原学监测。
本研究结果揭示了2009-2015年福建省福州市5岁以下急性腹泻住院儿童中NV的型别分布及其动态变化，但本研究尚存在一些不足，主要包括本次调查仅从一家哨点医院抽取样本，且NV隐性感染病例尚未纳入研究，因此该结果尚不能准确反映出该地区5岁以下儿童感染的NV型别分布及其动态变化。同时，NV感染引起的成人急性腹泻也常有报道[18]。但本次调查尚未覆盖5岁以上急性腹泻病例，因此无法全面反映出该地区全人群急性腹泻患者NV感染的型别分布及其动态变化。为全面了解NV在福建省福州市流行的型别分布及其动态变化，必须扩大监测范围和对象，并持续开展监测。本研究发现福建省福州市，特别是5岁以下急性腹泻儿童中NV流行的规律，能够为今后防治措施的制定提供一定的依据。
作者贡献:
黄业伟 ORCID：0000-0003-1356-0552
黄业伟：论文的主要完成人，质量控制、实验室检测工作和数据分析
吴冰珊：样本收集、流行病调查和实验室检测
陈凤钦：病例收集和提供标本
黄枝妙：样本收集、流行病调查和实验室检测
翁育伟、严延生：课题设计、论文指导和论文修改
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