宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁着女性健康，其发病率仅次于乳腺癌^[1]。研究表明，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染与子宫颈癌发病密切相关，系统有效的筛查是降低子宫颈癌发病率和病死率的最有效手段。目前，HPV已鉴定出100多种型别，根据致病性大小，将HPV分为低危型和高危型两大类。本研究采用流式荧光杂交法检测温州地区体检女性人群的HPV感染情况及亚型分布，为宫颈癌预防筛查和疫苗研制提供参考依据。

选择2014年6月至2016年5月在温州医科大学附属第二医院体检中心进行妇科检查的女性，共4 089例，平均年龄(39.25±8.55) 岁。所有入选女性均为单位健康体检者，个人体检者除外。依据年龄分为五组：≤29岁、30~岁、40~岁、50~岁、≥59岁。所有受试者均无心、肝、肾等重要脏器严重性疾病。

HPV基因分型试剂盒(上海透景生物技术有限公司)：可检测17个高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82、53和26型)和10个低危型(即6、11、43、83、40、44、81、55、42和61型)。使用仪器为基因扩增仪(德国Eppendorf公司，Mastercycler型)、流式荧光点阵分析仪(美国Luminex公司，Luminex 200型)。

由温州医科大学附属第二医院体检中心医务人员采集宫颈脱落细胞，将宫颈刷头部放入提取缓冲液管中，拧紧后保持直立放置，粘贴受检者条形码，采集宫颈脱落细胞标本，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，然后用宫颈刷插入宫颈口，紧贴宫颈口单方向旋转3~5圈，将宫颈刷头部折断放入标本保存液管中，旋紧盖子，贴好医嘱条形码，保存于4 ℃冰箱中，48 h内完成检测。

取混匀的待测标本及阳性质控品200 μl，14 000 r/min离心3 min，弃上清后加入200 μl预先摇匀的提取缓冲液，振荡混匀后置100 ℃水浴15 min，14 000 r/min离心5 min后，取5 μl上清作为PCR反应模板。

PCR反应体系总体积为20 μl，包括5 μl模板和15 μl PCR试剂，PCR试剂按以下比例配制，即PCR预混液10 μl、引物混合液5 μl、聚合酶0.8 μl。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5个循环；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸3 min。

按照样本个数，微孔杂交板中加入22 μl预混的微球杂交液，依此加入3 μl PCR扩增产物至微孔杂交板中，并吹打混匀，封板纸覆盖。95 ℃变性5 min，48 ℃杂交30 min。杂交后，每孔加入荧光素SA-PE 75 μl，封板纸重新覆盖.轻轻混匀后48 ℃孵育15 min。

将微孔杂交板移至预热好的Luminex 200多功能流式点阵仪上检测，读取微球编码及其对应的荧光强弱信号，经配套分析软件判读检测结果。

采用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析，检出率以阳性率(%)表示，计数资料采用χ²检验，比较不同年龄组HPV阳性率分布特征，P < 0.05为差异有统计学意义。

4 089例体检者，HPV阳性763例，HPV总感染率为18.66%；具体感染情况见表 1，最多检出7种亚型感染。

检测试剂包含的27种亚型均有检出，高危型感染率为14.06%，低危型感染率为6.29%。其中有69人检出高低危亚型混合感染，感染率为1.69%，见表 2。

经χ²检验，不同年龄组HPV总感染率差异有统计学意义(χ²=18.882，P < 0.01)。随着年龄的增加，HPV感染率也逐渐增加，≥59岁年龄组妇女感染率最高，与≤29岁、30~岁、40~岁、50~岁组比较差异有统计学意义(χ²分别为15.251、14.623、14.110、10.046，P均 < 0.05)。各年龄组多重感染率差异也有统计学意义(χ²=19.517，P < 0.01)，其中≥59岁年龄组最高，与≤9岁、30~岁、40~岁、50~岁组之间差异有统计学意义(χ²分别为15.778、19.741、16.113、13.449，P均 < 0.05)。各年龄组高危型感染率差异也有统计学意义(χ²=21.113，P < 0.01)，其中≥59年龄组最高，与≤29岁、30~岁、40~岁、50~岁组之间差异有统计学意义(χ²分别为17.437、14.352、14.021、12.477，P均 < 0.05)，见表 3。

HPV是一种双链嗜上皮性DNA病毒，属乳多空病毒科，主要侵犯人体生殖道，可诱发如宫颈炎、生殖器疣等生殖道病变，其中高危型HPV持续感染是宫颈癌变发生的危险因素^[2-3]。HPV感染已成为最常见的性传播疾病，具有明显的异质性，其分布也存在种族和地域差异性，对HPV进行大样本分子流行病学研究以及建立地区性HPV感染流行度及优势型别基因库具有重要的临床意义^[4-5]。

本研究以浙江温州地区的4 089例体检女性作为研究对象，研究结果显示，HPV总体感染率为18.66%，检测试剂盒中包含的27种亚型均有检出，提示温州地区HPV的亚型分布较为广泛，也可能与本研究采用的流式荧光杂交技术具有较高灵敏度有关^[6]。我们的研究显示，温州地区体检女性感染以单一型感染为主，多重感染中以二重感染最常见，而四重及以上感染非常少见。高危型感染占所有感染者的75.36%，其中52、53型最为常见。52型感染率明显高于其他亚型，这与国内其他地区的报道较为一致^[7-8]。53型感染率排第2位，这在国内少有相似报道，可能与检测方法有关，早先常用的实时荧光PCR法和HC2-HPV DNA检测法均不包含53型，存在一定的漏检率。欧美国家较为常见16、18型，在温州地区体检人群中感染率排在第3和第5位。研究结果表明温州地区女性人群HPV感染基因型与其他地区相比具有一定的独特性，因此在研发针对本地区的HPV疫苗时，除了目前主要的16、18亚型，还应多注重52、53、58等亚型。

我们在研究不同年龄组HPV的感染情况时发现，随着年龄的增长，HPV总感染率、高危型感染率均有增加的趋势。尤其是≥59岁年龄组，其总感染率、高危型感染率、多重感染率均明显高于其他组别，可能是高龄女性由于绝经后卵巢功能下降，体内雌激素水平降低，保护性乳酸杆菌的减少，使得机体免疫力也会逐渐减弱，导致自身清除HPV的能力逐渐下降^[9-10]。所以高龄女性若发现HPV感染，更应引起重视，并及时做进一步处理。年轻女性的HPV感染率并没有出现高峰，这与国内多数报道并不一致^[11-12]，可能是由于≤29岁年龄组的例数偏少，存在统计学上的误差，也可能与所选择的人群有关，研究对象为单位健康体检人群，主要包括医务人员、教育工作者、公务员等职业女性，文化水平及安全意识相对较高，具有较好的生活规律及卫生习惯。

本文病例来源于一个医院的体检人群，仅能在一定程度上反映温州地区部分女性HPV感染具有显著的亚型及年龄分布异质性，尚需扩大人群范围进行进一步验证，为HPV感染早期预防和治疗提供重要的临床参考。

作者贡献:

叶宣梅  ORCID：0000-0003-2935-2598

叶宣梅：实验操作及论文撰写

叶松道：论文指导

卢雨田：资料及标本搜集