Spread and characteristics of Vibrio parahaemolyticus in Lishui, Zhejiang, 2014–2018
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摘要:目的了解2014 — 2018年浙江省丽水市副溶血弧菌（Vp）的流行情况、血清型别、携带毒力基因情况及分子分型特征，为预防食源性疾病提供依据。方法分别收集2014 — 2018年丽水市食源性疾病监测中的11 420例临床腹泻患者粪便与食品安全风险监测中的497份食品标本，进行Vp的分离培养，分析阳性菌株的分布特征。 同时对菌株开展血清分型，毒力基因检测和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型。结果共分离到296株Vp，其中251株来源于腹泻患者粪便，45株来源于食品。 丽水市Vp流行集中于第三季度，患者集中于成年人，且在家庭用餐占多数。 患者来源菌株主要血清型为O3∶K6，毒力基因型为tdh+trh-tlh+，食品来源菌株主要血清型为O2，毒力基因型为tdh-trh-tlh+。 48株Vp可分为42个PFGE带型，带型相似值为 6.16% ~ 100.00%。结论第三季度为Vp的卫生监管重点，要加强对饮食习惯尤其是家庭用餐时对水产品正确处理方面的宣教。 丽水市目前流行的菌株基因相似度低，可能存在多克隆来源。重点监测血清型患者为O3∶K6，食品为O2。Abstract:ObjectiveTo investigate the spread, serotype, virulence gene and molecular typing characteristics of Vibrio parahaemolyticus in Lishui of Zhejiang province and provide evidence for the prevention of foodborne diseases.MethodsA total of 11420 stool samples of clinical diarrhea patients in foodborne disease surveillance and 497 food samples in food safety risk surveillance were collected in Lishui from 2014 to 2018 for the isolation and culture of V. parahaemolyticus, and the distribution characteristics of positive strains were analyzed. Serological typing, virulence gene detection and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) for molecular typing were performed for the strains.ResultsA total of 296 strains of V. parahaemolyticus were isolated, in which 251 were from diarrhea patients and 45 were from foods. V. parahaemolyticus was mainly detected during July-September, The cases were mainly adults and most of them usually dined at home. O3∶K6 was the main serotype and tdh+trh-tlh+ was the virulence genotype detected in patients. O2 was the main serotype and tdh-trh-tlh+ was the virulence genotype detected in foods. Forty eight strains of V. parahaemolyticus could be classified into 42 PFGE banding patterns, and the banding pattern similarity values were from 6.16% to 100.00%.ConclusionIt is necessary to strengthen the health supervision for V. parahaemolyticus infection and health education about having a good dining habit and improving the household cooking process of aquatic products during July-September. The genetic similarity of the V. parahaemolyticus strains spreading in Lishui was low and polyclonal sources might exist. Serotype O3∶K6 was mainly detected in patients, and O2 was mainly in foods.
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副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, Vp）是一种食源性病原菌，广泛分布于沿海的海水及海产品中，夏秋季节由Vp引起的疾病常呈群体性发生，在我国沿海地区已占据细菌性食物中毒的首位［1］。近些年来，由于交通的发展，海产品越来越多的运往内地供人们消费，因此，内地Vp感染的比例也呈现上升趋势［2］。为了解Vp近年来在丽水市的流行情况及血清型、毒力基因、分子分型情况，本研究收集了2014－2018年5年间从腹泻患者粪便中分离的251株Vp和食品中分离到的45株Vp进行分析，为Vp引起的疾病暴发预警、流行病学调查及溯源提供实验室数据。
1. 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样本来源
患者样本来源于2014－2018年丽水市食源性疾病监测系统中的11 420例临床腹泻患者粪便，病例定义为排便异常（稀便、水样便、黏液便或脓血便等）日均≥3次。共获得251株Vp。食品样本来源于2014－2018年丽水市食品安全风险监测中的497份食品，共获得45株Vp。
1.1.2 主要试剂
弧菌显色平板购于广东环凯微生物科技有限公司；生化鉴定卡由法国梅里埃公司生产；Vp（trh、tdh、tlh）三重核酸检测预分装试剂盒（荧光PCR法）购自深圳生科原生物股份有限公司；O抗原、K抗原诊断血清由日本生研公司生产；限制性内切酶SfiⅠ、XbaⅠ和蛋白酶 K 由美国Promega公司生产。
1.1.3 主要仪器
7500荧光PCR仪由美国 ABI 公司生产，脉冲场凝胶成像系统GelDoc XR+及电泳系统CHEF MapperXA由美国 Bio-Rad 公司生产。
1.2 方法
1.2.1 Vp的分离鉴定
食品样品处理及Vp的分离鉴定参照《GB 4789.7－2013 食品安全国家标准食品微生物检验副溶血弧菌检验》方法检测。患者粪便样本按照WS 271－2007 《感染性腹泻诊断标准》方法进行Vp分离菌培养。
1.2.2 Vp的毒力基因检测
采用深圳生科原生物股份有限公司生产的Vp(trh、tdh、tlh) 三重核酸检测预分装试剂盒（荧光PCR法）检测Vp的trh、tdh、tlh毒力基因。
1.2.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）
参照中国疾病预防控制中心发布的PFGE 分子分型标准化实验室操作手册进行试验，使用SfiⅠ限制性内切酶进行酶切，使用沙门标准株H9812作为分子质量标准。聚类分析使用致病菌识别网专用软件。
1.3 统计分析
采用Excel软件建立数据库，以 SPSS 13.0软件进行统计分析，采用χ2检验比较差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 Vp的流行情况
2.1.1 Vp阳性标本主要检出时间
不同季度Vp检出率差异明显。2014－2018年期间，腹泻患者粪便和食品中Vp的检出主要集中于第三季度。其中腹泻患者粪便来源菌株第三季度检出率为5.10%，高于其他3个季度的检出率，差异有统计学意义（χ2＝84.60、94.84、106.22，均P＜0.05）。食品来源菌株第三季度检出率为21.97%，高于其他3个季度的检出率，差异有统计学意义（χ2＝5.20、32.25、21.68，均P＜0.05），见表1。
表 1 2014－2018年丽水市腹泻患者粪便和食品中副溶血弧菌检出情况Table 1. Detection of V. parahaemolyticus in patients and foods in Lishui, 2014–2018采样季度 患者 食品 样本数（份） 阳性数（例） 检出率（%） 样本数（份） 阳性数（例） 检出率（%） 一 1 673 1 0.06 24 0 0.00 二 2 911 25 0.86 162 2 1.23 三 4 120 210 5.10 173 38 21.97 四 2 716 15 0.55 138 5 3.62 合计 11 420 251 2.20 497 45 9.05 2.1.2 Vp阳性标本的检出年龄分布
2014－2018年期间共对11 420份腹泻患者粪便标本进行了Vp的检测，共检出阳性菌株251株，总阳性率为2.20%。在检出阳性的标本中，以20 ~ 60岁年龄组居多，占78.88%（198/251），老年人（＞60周岁）占11.55%（29/251），儿童占9.56%（24/251）。
2.1.3 Vp阳性检出病例就餐场所及暴露食品情况
从251例患者流行病学调查情况来看，进食场所分类占比分别为家庭55.78%（140/251）、餐饮服务业4.77%（12/251）、集体食堂0.80%（2/251）、零售市场0.80%（2/251）、农村宴席0.40%（1/251）、其他37.45%（94/251）。就医前食品种类构成比为水产品及其制品35.86%（90/251）、肉与肉制品8.37%（21/251）、水果类及其制品7.57%（19/251）、混合食品5.58%（14/251）、其余食品构成比均＜5%。
2.2 Vp的血清型分布情况
2014－2018年临床腹泻患者粪便中分离到的Vp包括17种血清型，以O3血清型为主，占78.49%（197/251），其次是O4，占10.76%（27/251）。食品中分离到的Vp覆盖了14种血清型，以O2血清型为主，占35.56%（16/45），其次是O3，占22.22%（10/45），见表2。
表 2 2014－2018年副溶血弧菌血清型分布Table 2. Distribution of serotypes of V. parahaemolyticus, 2014–2018血清型 2014年 2015年 2016年 2017年 2018年 总计 患者 食品 患者 食品 患者 食品 患者 食品 患者 食品 患者 食品 O2 0 2 0 0 0 10 0 2 0 2 0 16 O3 36 0 33 0 62 5 40 2 26 3 197 10 O4 2 0 1 0 10 2 8 2 6 1 27 5 其他 11 1 6 1 3 4 3 4 4 4 27 14 合计 49 3 40 1 75 21 51 10 36 10 251 45 注：其他血清型包括O1、O5、O6、O10、O11 2.3 Vp的毒力基因分布情况
选取了2018年全年及2017年部分菌株做了毒力基因检测，毒力基因主要以tdh+trh-tlh+和tdh-trh-tlh+为主（64/66）。在主要的2种基因型中，腹泻患者粪便来源菌株毒力基因以tdh+trh-tlh+为主，占95.56%（43/45），食品来源菌株毒力基因以tdh-trh-tlh+为主，占76.19%（16/21），差异有统计学意义（χ2＝38.69，P＜0.01），见表3。
表 3 2017－2018年不同来源副溶血弧菌毒力基因型分布Table 3. Distribution of virulence genotypes of V. parahaemolyticus from different sources, 2017–2018毒力基因型 腹泻患者粪便 食品 总计（株） 数量（株） 构成比（%） 数量（株） 构成比（%） tdh+trh-tlh- 1 2.22 0 0.00 1 tdh+trh-tlh+ 43 95.56 4 19.05 47 tdh-trh+tlh+ 0 0.00 1 4.76 1 tdh-trh-tlh+ 1 2.22 16 76.19 17 合计 45 100.00 21 100.00 66 2.4 部分Vp菌株的PFGE聚类结果
对2017－2018年分离获得的经过毒力基因检测的66株Vp菌株，采用限制性内切酶SfiⅠ酶切后电泳，部分菌株降解，共得到有效图谱48个，其中36个来源于患者，12条来源于食品。利用国家致病菌识别网软件分析，相似度为6.16% ~ 100.00%。根据电泳产生条带的位置和数量的不同，共呈现出42个不同的PFGE型别，分别命名为S1 ~ S42型，相似度达到85.00%以上的克隆系有8个，按聚类图从上到下分别是85.37%（2株）、100.00%（2株）、86.67%（2株）、87.73%（5株）、100.00%（2株）、89.73%（7 株）、88.24%（2株）、91.09%（3株），其余23株之间相似度全部＜85.00%。12株食品来源的菌株没有1株与患者同源性高于85.00%，见图1。
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图 1 48株副溶血弧菌的脉冲场凝胶电泳聚类分析Figure 1. PFGE cluster analysis on 48 strains of V. parahaemolyticus3. 讨论
Vp是一种嗜盐的革兰阴性、食源性致病菌，在近海的淤泥、海水等环境及贝类、鱼、虾等海产品中广泛存在［3］。由于交叉污染等原因，淡水产品中也可被大量检出［4］。Vp感染引起的食源性疾病发病率高低与当地海产养殖消费水平息息相关［5］。丽水市水产品消费量较大，近年来，由Vp引起的食物中毒所占比例较高。监测数据显示，患者和食品中Vp的第三季度的检出均占所有阳性菌株的80.00%以上，且集中在8月。成年人患病占78.88%，且55.78%患者就餐场所为家庭，就医前食用水产动物及其制品的占比最大。有研究表明，5－10月气温高、湿度大、水温适宜，适合Vp生长繁殖，在一定的范围内，Vp的检出随温度的升高而升高［6］。2014－2018年丽水市Vp流行情况提示，本地卫生监督部门从养殖领域到餐厅要加强监督管理，尤其是第三季度要加强监测。同时，食品安全部门对成年人的健康宣教必不可少，养成良好的生活习惯尤为重要，特别在家庭用餐时对水产品的正确加工，不吃生食或半生食水产动物及其制品。
Vp的致病因子主要是耐热溶血素（TDH）、拟溶血素（TRH）和不耐热溶血素（TLH）。TDH能使人或兔红细胞溶血，即产生神奈川现象。TRH具有与TDH相似的毒性如致死作用和肠毒素作用，但却不能溶血。TLH和卵磷脂结合能使绵红细胞溶血。有研究报道，TLH没有致病性，为Vp的特异性基因［7–8］。丽水市的监测结果显示，不同来源的菌株除一株患者来源的菌株外，所有菌株携带tlh基因，与报道相符。丽水市腹泻患者粪便来源菌株优势血清型为O3∶K6，且每年检出率均在66.67%以上，与王云霞等［9］和李雪等［10］的监测结果相似。97.78%的菌株为tdh+，trh-，为1996 年后在中国大陆的“大流行菌群” ［11］。但是，食品来源的菌株血清型与患者来源菌株差异较大，以O2血清型为主，情况类似于秦磊等［12］在河北省唐山市的监测结果。同时，在毒力基因上也存在自身的特点，以tdh-trh-tlh+为主，与李雪等［10］报道相似。尽管如此，有报道显示，不携带tdh、trh基因的Vp可能存在其他未知的致病因子，也能引起急性胃肠炎［13］，故仍需开展持续监测。
PFGE现在已经逐渐成为细菌分型的“金标准”，能在基因层面上分析菌株之间相互关系。从本次PFGE分型结果可见，2017－2018年丽水市腹泻患者粪便和食品中分离的48株Vp具有多态性，按照Tenover等［14］提出的菌株同源性判别标准，相似值＞85.00%有流行病学相关仅8个分散的小克隆系。研究结果说明丽水地区流行的Vp基因相似度很低，没有明显的流行病学关系。此结果和广州市等地Vp流行情况相似［15–16］。值得注意的是，12株食品来源的菌株除了血清型和毒力基因与患者来源菌株差距较大外，基因分型也无同源性，值得后续探究。
综上所述，丽水市Vp的流行具有明显的季节性，卫生监督部门监管工作重点在第三季度，要加强对群众饮食习惯尤其是家庭用餐时对水产品的正确处理方面的宣传。目前流行的O3∶K6血清型为腹泻患者重点监测血清型，O2血清型为水产品重点监测的血清型。Vp作为丽水市一种主要的感染性致病菌，认识其流行规律，对有针对性地开展工作至关重要。本研究在丽水市患者和食品中流行的Vp开展流行病学资料分析，同时对菌株开展血清分型，毒力基因检测，PFGE分子分型，可为预防食源性疾病提供依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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图 1 48株副溶血弧菌的脉冲场凝胶电泳聚类分析
Figure 1. PFGE cluster analysis on 48 strains of V. parahaemolyticus
表 1 2014－2018年丽水市腹泻患者粪便和食品中副溶血弧菌检出情况
Table 1 Detection of V. parahaemolyticus in patients and foods in Lishui, 2014–2018
采样季度 患者 食品 样本数（份） 阳性数（例） 检出率（%） 样本数（份） 阳性数（例） 检出率（%） 一 1 673 1 0.06 24 0 0.00 二 2 911 25 0.86 162 2 1.23 三 4 120 210 5.10 173 38 21.97 四 2 716 15 0.55 138 5 3.62 合计 11 420 251 2.20 497 45 9.05 
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表 2 2014－2018年副溶血弧菌血清型分布
Table 2 Distribution of serotypes of V. parahaemolyticus, 2014–2018
血清型 2014年 2015年 2016年 2017年 2018年 总计 患者 食品 患者 食品 患者 食品 患者 食品 患者 食品 患者 食品 O2 0 2 0 0 0 10 0 2 0 2 0 16 O3 36 0 33 0 62 5 40 2 26 3 197 10 O4 2 0 1 0 10 2 8 2 6 1 27 5 其他 11 1 6 1 3 4 3 4 4 4 27 14 合计 49 3 40 1 75 21 51 10 36 10 251 45 注：其他血清型包括O1、O5、O6、O10、O11
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表 3 2017－2018年不同来源副溶血弧菌毒力基因型分布
Table 3 Distribution of virulence genotypes of V. parahaemolyticus from different sources, 2017–2018
毒力基因型 腹泻患者粪便 食品 总计（株） 数量（株） 构成比（%） 数量（株） 构成比（%） tdh+trh-tlh- 1 2.22 0 0.00 1 tdh+trh-tlh+ 43 95.56 4 19.05 47 tdh-trh+tlh+ 0 0.00 1 4.76 1 tdh-trh-tlh+ 1 2.22 16 76.19 17 合计 45 100.00 21 100.00 66
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