霍乱是由霍乱弧菌引起的甲类传染病，霍乱弧菌最重要的致病因素是霍乱毒素，能够产生霍乱毒素的霍乱弧菌称为霍乱弧菌产毒株。在已经发现的200多个血清群的霍乱弧菌中，O1群和O139群是最常见的导致霍乱流行的两个血清群。通常认为非产毒株只会引起散发病例，但近年来持续发现由非O1/非O139群霍乱弧菌非产毒株导致的腹泻暴发^［1］。另外，从肝硬化等免疫力低下的病例血液中偶尔分离到非O1/非O139群霍乱弧菌，这些菌株通常也不携带霍乱毒素基因。这两个来源的非O1/非O139群霍乱弧菌的药物敏感性和基因组特征的研究很少。本研究收集了2018－2021年间湖南省腹泻病例肠道标本分离的非O1/非O139群霍乱弧菌4株和非腹泻病例血液标本分离的非O1/非O139群霍乱弧菌3株，对其进行血清学分群、药物敏感性检测和基因组序列测定，分析其药物敏感性及基因组特征的差异。

1.   材料和方法

1.1   资料及菌株来源

2018－2021年间湖南省腹泻病例肠道标本分离的非O1/非O139群霍乱弧菌4株和非腹泻病例血液标本分离的非O1/非O139群霍乱弧菌3株。基本信息见表1。

表  1  7株人源非O1/非O139群霍乱弧菌菌株基本信息

Table  1.  Basic information of 7 non-O1/non-O139 Vibrio choleraeof human isolates

菌株编号	菌株来源环境	菌株来源地区	样品类型	菌株分离时间（年/月/日）	临床诊断
HN18VC001	病例	长沙市	血液	2018/09/10	肝硬化
HN20VC001	病例	湘潭市	粪便	2020/06/11	感染性腹泻
HN20VC004	病例	岳阳市	血液	2020/09/04	肺部感染
HN20VC005	病例	邵阳市	血液	2020/10/15	肝脓肿
HN21VC001	病例	长沙市	粪便	2021/05/30	感染性腹泻（有肝硬化）
HN21VC002	病例	张家界市	粪便	2021/06/08	感染性腹泻
HN21VC003	病例	长沙市	粪便	2021/07/16	感染性腹泻

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1.2   主要试剂与仪器

VITEK 2 GN生化鉴定卡（梅里埃公司）， 药敏条E-test条（意大利利飞驰公司），MH琼脂平板培养基（广东环凯微生物科技有限公司），霍乱弧菌CTXAB核酸检测预分装试剂盒（荧光PCR试剂盒，深圳生科原生物股份有限公司），霍乱弧菌诊断单抗（玻片凝集法，郑州万泰生物科技有限公司）。主要仪器包括高通量实时荧光定量PCR仪（QuantStudio 7，ABI），全自动细菌鉴定药敏分析系统（VITEK2compact，梅里埃），GeneRotex96核酸提取仪（西安天隆），超声波破碎仪（Covaris），高通量测序平台NovaSeq6000（Illumina）。

1.3   方法

1.3.1   生化和血清学鉴定

对7株菌株，分别以梅里埃公司VITEK2compact和郑州万泰公司霍乱弧菌诊断单抗进行了生化鉴定和血清学鉴定。

1.3.2   药物敏感试验

参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的指南（2019版），按照湖南省霍乱监测方案推荐的12种抗菌药物，采用E-test试条法进行药物敏感性测试，将非O1/非O139群霍乱弧菌新鲜培养物以肉汤制备菌悬液并调浓度至0.5麦氏单位浊度后，均匀涂布于MH琼脂，将E-test试条贴其表面，置温箱37 ℃培养18～24 h。E-test试纸条共12种，分别是氨苄西林（AMP，0.016～256 µg/mL）、四环素（TE，0.016～256 µg/mL）、诺氟沙星（NOR，0.016～256 µg/mL）、复方新诺明（SXT，0.002～132/19 µg/mL）、氯霉素（C， 0.016～256 µg/mL）、头孢噻肟（CTX，0.002～32 µg/mL）、庆大霉素（CN ，0.016～256 µg/mL）、萘啶酸（NA，0.016～256 µg/mL）、环丙沙星（CIP ， 5 µg）、米诺环素（MH，0.016～256 µg/mL）、头孢曲松（CR0，0.002～32 µg/mL）、美罗培南（MEM，0.002～32 µg/mL）。最后根据CLSI的标准判定结果为敏感、中介或者耐药。药敏质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603以及大肠埃希菌ATCC25922，湖南省疾病预防控制中心微生物实验室留存备用。

1.3.3   二代测序

使用天隆GeneRotex96核酸提取仪，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取核酸。核酸以Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保文库质量。按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库合并至flowcell，cBOT成簇后使用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行测序。

1.3.4   遗传学分析

从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的DNA序列数据库（GenBank）中下载在公开发表刊物中涉及的的非O1/非O139群霍乱弧菌的基因组序列（截止2022年1月），将这些数据与7株霍乱弧菌的基因组序列整合，基于非重复、非重组的核心基因组区域的单核苷酸变异（Single nucleotide variation，SNV），使用IQ-tree构建最大似然树。之后，使用这7株霍乱弧菌的基因组序列，基于核心基因组区域的SNV构建最大似然树；同时对这7株霍乱弧菌的基因组序列进行泛基因组分析。

2.   结果

2.1   药物敏感试验与耐药基因检测

3株血液分离株对氨苄西林、诺氟沙星、头孢曲松、美罗培南、米诺环素、复方磺胺甲恶唑、庆大霉素、头孢噻肟、萘啶酸、环丙沙星全部敏感；1株对四环素中介，1株对氯霉素的耐药（表2）。4株粪便分离株对诺氟沙星、头孢曲松、美罗培南、米诺环素、复方磺胺甲恶唑、庆大霉素、头孢噻肟全部敏感；1株对四环素、氯霉素均为中介，1株对氯霉素耐药，2株对氨苄西林、环丙沙星、萘啶酸均为耐药。其中1株对氨苄西林、萘啶酸、环丙沙星二重耐药；1株对氨苄西林、萘啶酸、环丙沙星、氯霉素多重耐药（表2）。基于基因组数据的耐药基因检测结果显示，分离自粪便样品的菌株携带较多的耐药基因（4～8个），而分离自血液样品的菌株携带较少的耐药基因（1～2个）。分离自粪便样品菌株携带的部分耐药基因与其表现出的耐药表型一致。例如，携带floR基因的菌株对氯霉素具有耐药性。携带blaCARB-2基因的菌株对氨苄西林具有耐药性。

表  2  7株非O1/非O139群霍乱弧菌对8类抗菌药物的药敏结果

Table  2.  Drug sensitivity of 7 strains of non-O1/non-O139 Vibrio cholerae to 8 classes of antibiotics

抗菌药物	敏感			中介			耐药
	粪便来源菌株（n=4）	血液来源菌株（n=3）		粪便来源菌株（n=4）	血液来源菌株（n=3）		粪便来源菌株（n=4）	血液来源菌株（n=3）
青霉素类 　氨苄西林	2	3		0	0		2	0
四环素类 　四环素 　米诺环素	3 4	2 4		1 0	1 0		0 0	0 0
磺胺类 　复方新诺明	4	4		0	0		0	0
头孢菌素类 　头孢噻肟 　头孢曲松	4 4	4 4		0 0	0 0		0 0	0 0
碳青霉稀类 　美罗培南	4	4		0	0		0	0
酰胺醇类 　氯霉素 　氨基糖苷类 　庆大霉素	2 4	2 4		1 0	0 0		1 0	1 0
喹诺酮类 　环丙沙星 　萘啶酸 　诺氟沙星	2 2 4	4 4 4		0 0 0	0 0 0		2 2 0	0 0 0

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2.2   二代测序与遗传学分析

将7株非O1/非O139群霍乱弧菌的基因组序列与GenBank中的非O1/非O139群霍乱弧菌的基因组序列整合，基于非重复、非重组的核心基因组区域的SNV，使用IQ-tree构建最大似然树基于基因组构建的最大似然树，7株菌的基因组处于5个不同的遗传分支（图1）。HN21VC001和HN21VC002处于同一个遗传分支，HN20VC004和HN20VC005分别处于同一个遗传分支，而且同一分支的两株菌之间检测不到SNV。为了排除基因组之间差异过大导致这两组基因组内部之间检测不到SNV的可能性，我们对这7株菌株进一步进行了核心基因组（图2）和泛基因组（图3）分析。结果提示，HN21VC001和HN21VC002之间以及HN20VC004和HN20VC005之间确实检测不到SNV，且泛基因组分析也提示这两组菌株内部高度一致，例如，HN21VC001和HN21VC002之间只有2个开放阅读框（Open reading frame，ORF）的差异，而HN20VC004和HN20VC005之间只有7个ORF的差异。

图  1  基于非O1/非O139群霍乱弧菌基因组非重复、非重组核心区SNV构建的聚类关系树

注：红色标识的湖南省2018－2021年间人源非O1/非O139群霍乱弧菌的基因组序列，黑色标识的在公开发表刊物中涉及的非O1/非O139群霍乱弧菌的基因组序列

Figure  1.  Cladogramconstructed based on the SNV in the non-repetitive, non-recombinant core genome of non-O1/non-O139 Vibrio cholerae

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图  2  基于7株分离自湖南患者的非O1/非O139群霍乱弧菌基因组非重复、非重组核心区SNV构建的聚类关系树

注：左边为聚类关系树，右边为毒力岛、毒力因子以及耐药基因的分布。红色文字的为分离自血液的菌株，黑色文字为分离自粪便的菌株，右侧数字为相似度

Figure  2.  Cladogram constructed based on the SNV in the non-repetitive, non-recombinant core genome of 7 non-O1/non-O139 Vibrio cholerae isolated from patients

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图  3  基于7株分离自湖南患者的非O1/非O139群霍乱弧菌基因组附属基因组的聚类树

Figure  3.  Cladogram constructed based on the presence and absence of genes in the accessory genome of 7 non-O1/non-O139 Vibrio cholerae isolated from patients

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我们同时检测了霍乱弧菌中常见的毒力基因、基因组岛以及耐药基因在这些基因组中的存在情况。我们发现，这7个基因组中均检测不到VPI-1、VSPII、T3SS和T6SS，仅仅在HN18VC001和HN20VC001中检测到VPI-2基因组岛、在HN18VC001中检测到VSPI基因组岛（图2）。

3.   讨论

到目前为止，在全球范围内，O1群和O139群霍乱弧菌仍然是导致霍乱暴发或者大流行的主要病原体^［2］。然而，我国自2010年之后，从病例分离的O1群和O139群霍乱弧菌逐渐减少，而从病例分离到的非O1/非O139群霍乱弧菌的报告越来越多^［3］。这些非O1/非O139群霍乱弧菌，从来源上大致可以分为两类，腹泻患者粪便分离^［4］以及非腹泻患者血液等体液分离^［5］ 。国际上也有腹泻患者粪便和其他体液分离到非O1/非O139群霍乱弧菌的报告^［6］。这些菌株通常不携带ctxAB基因，也不携带大流行霍乱弧菌中常见的基因组岛。但是有些菌株携带T3SS，这被认为是非O1/非O139群霍乱弧菌重要的致病因子^［7］。此外，某些非O1/非O139群霍乱弧菌中也检测到多个耐药基因^［7］。本研究中的7株菌株均未检出ctxAB基因，也未检出VPI-1、VSPII、T3SS和T6SS。因此推测这些菌株可能携带某些其他的致病因子，需要对基因组序列进行进一步的研究。但是，也存在另一种可能，即这些霍乱弧菌只是伴随分离到，并非导致疾病的病原体。

近些年来，不时有从病例、特别是免疫力低下的病例的血液或者其他体液中分离到非O1/非O139群霍乱弧菌的报告^［8–9］。这些菌株与其他非O1/非O139群霍乱弧菌的差异是我们关注的问题。本研究中我们发现，分离自患者体液中的非O1/非O139群霍乱弧菌从整体上来说有一定的差异；但是，我们也看到分离自两个城市、分离时间相差一个多月的2株菌株（HN21VC001和HN21VC002）之间在核心基因组水平上未检测到SNV（图2）。两株分离自粪便的菌株（HN20VC004和HN20VC005）在核心基因组水平上也没有差异，均携带7种相同的耐药基因。这两位患者均长期腹泻，抗生素的应用可能是导致这些携带多耐药基因的菌株被筛选出来的原因。与粪便来源菌株相比，血液来源菌株的耐药基因无论从数量还是种类上来说，都要少很多（图2），这可能与菌株生存环境的抗生素压力不同有关。但是，从药物敏感性实验来看，我们没有观察到两个群体对抗生素的敏感性的差异具有统计学意义。这可能与抗生素的选择和菌株数量偏少有关，一些粪便来源菌株耐药基因所对应的抗生素，并没有在我们的药物敏感性实验中涉及。我们将继续收集菌株，根据耐药基因的存在情况，针对性的设计药物敏感性实验，来检测两个群体耐药表型的差异。

本研究对病例来源的非O1/非O139群霍乱弧菌进行了基因组变异和耐药分析，特别是对来源于体液和来源于粪便的菌株进行了比较，发现了两者之间的一些差异。然而，本研究所涉及的菌株无论从分离的年代还是分离的地域来说，其代表性都不够理想。因此，我们的结论目前不具备外推的基础。下一步，我们将收集全国乃至全球的非O1/非O139群霍乱弧菌的基因组和耐药信息，进行系统的分析。

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

志谢　长沙市疾病预防控制中心、湘潭市疾病预防控制中心、邵阳市疾病预防控制中心、岳阳市疾病预防控制中心