T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞，在正常情况下，各淋巴细胞亚群互相作用，维持机体免疫功能的正常，当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，就可导致机体免疫功能紊乱。人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)主要是侵犯人CD⁺₄T淋巴细胞，致使其数量上减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被破坏而造成免疫功能低下，从而导致各种机会感染和肿瘤^[1]。因此，对淋巴细胞亚群特别是CD⁺₄T淋巴细胞的检测在评价HIV感染者的免疫状况、疾病进展及预后判断等方面都有非常重要的作用。
美国公共卫生署建议：HIV感染者应每隔3~6个月对CD⁺₄T淋巴细胞水平进行监控 ^[2]。HIV感染者需要定期检测CD⁺₄T淋巴细胞值，但是该项检测所需仪器和试剂昂贵且操作复杂，未能在医疗机构普遍开展，一般是集中到定点机构集中进行检测，待检的新鲜抗凝全血样品不可能在采后立即检测，而血样的CD⁺₄T淋巴细胞值会随保存时间的延长而产生变化，因此，需要了解血样能存放的时间。探索在不影响检测结果前提下的血样保存最长时限，为准确检测CD⁺₄T淋巴细胞提供参考标准，以保证结果的准确性和可靠性。
1.1 样本来源
　　HIV感染者定期由随访工作人员采集全血送到实验室进行CD⁺₄淋巴细胞检测，随机选取了余姚市送检的12份HIV感染者的全血样本，这些感染者均经新加坡产的HIV确认试剂Genelabs HIV BLOT2.2确认为HIV阳性。
1.2 试剂与仪器
　　试剂采用贝克曼公司的四色荧光标记单克隆抗体CD4/CD8/CD3/CD45；绝对计数试剂为FLOWCOUNT；质控血为IMMUNOTROL；光路校准试剂为FLOWCHECK。自制ABC溶血液(A液：甲酸1.2 ml/L；B液：碳酸钠6.0 g/L、氯化钠14.5 g/L、硫酸钠31.3 g/L；C液：多聚甲醛10.0 g/L)。仪器使用美国贝克曼公司的COULTER EPICS XL型流式细胞仪和COULTER Q-PREP溶血仪。
1.3 方法　　　　
1.3.1 样本处理
　　采集外周静脉血5 ml，用EDTA抗凝，置普通冰箱4~8 ℃冷藏保存，在采血后5 d内不同时间进行检测。检测分别为采血后5(相当于采血后即时检测)、24、48、72、96、120 h。分别向试管中加入10 μl CD4/CD8/CD3/CD45四色荧光抗体和100 μl全血，混匀后室温避光保存20 min，在溶血仪上溶血后加入100 μl FLOWCOUNT荧光计数球，避光待检。质控取100 μl质控血IMMUNOTROL，其他步骤同上。
1.3.2 上机检测
　　用FLOWCHECK校准光路，使所有荧光信号的变异系数(CV)均小于2%。CD45淋巴细胞设门，计数5000个淋巴细胞后记录样本的CD⁺₄淋巴细胞绝对计数。每次检测都用IMMUNOTROL质控血监测试验的重复性和准确性。
1.4 统计分析
　　应用SPSS 16软件包 中 GLM(一般线性模型)的Repeated Measures过程对不同保存时间CD⁺₄T淋巴细胞检测值进行重复测量方差分析，通过球形检验(Mauchly’S Test of Sphericity)的结果判断重复测量数据之间是否存在相关性， P<0.05时使用Greenhouse-Geisser校正。并对不同时间点的测量数据与基线进行两两比较，统计各组检测数据之间的差异程度，P≤0.05时差异有统计学意义。
2.1  CD⁺₄淋巴细胞绝对计数情况
　　12份HIV感染者血样以1~12进行编号，在采血后分别进行6次CD⁺₄淋巴细胞检测，检测时间为采血后5、24、48、72、96、120 h。同一病例6次检测结果均数分布在172～461个/μl之间不等，其中最低为 118个/μl,最高为530个/μl。各分组的具体检测数及均值见表1(CD⁺₄淋巴细胞检测值单位为个/μl)。

表1 12份HIV感染者血样保存不同时间的CD⁺₄淋巴细胞检测值
Table 1 CD⁺₄ number in 12 HIV infected blood samples at different storage time

编号	5 h	24 h	48 h	72 h	96 h	120 h	均数	标准差	变异系数
1	237	206	219	219	209	203	216	12	5.8
2	221	236	236	215	200	195	217	17	8.0
3	530	474	482	437	461	383	461	49	10.6
4	290	324	272	250	220	224	263	40	15.3
5	343	322	320	286	286	276	306	27	8.7
6	351	324	308	278	277	267	301	33	10.9
7	471	444	399	384	371	304	396	59	14.8
8	224	240	233	211	214	187	218	19	8.6
9	200	191	186	186	150	118	172	31	18.3
10	462	424	423	374	362	311	393	54	13.8
11	333	345	330	311	296	245	310	36	11.7
12	457	414	446	380	432	350	413	41	9.9

2.2 血样保存不同时间的CD⁺₄淋巴细胞检测值变化率
　　把采血后5 h的CD⁺₄淋巴细胞检测值作为即时检测值，将后面5次的检测值分别与其进行比较，算出血样保存不同时间检测值的变化率。该次检测值变化率计算公式为(采血后5 h检测值-该次检测值)/采血后5 h检测值。从图1可以看出，淋巴细胞检测值变化率随着保存时间的增加而增大。在冷藏保存条件下，血样保存24 h后检测值变化率基本在10%以内，而保存5 d即120 h后，检测值变化率基本在20%以上，最高的高达41%。

图1 保存不同时间的CD⁺₄淋巴细胞检测值变化率
Figure 1 Change rate of CD⁺₄ number at different storage time
2.3 不同保存时间的检测值的统计分析
　　经统计分析，各组时间的CD⁺₄T淋巴细胞检测值间差异有统计学意义(F=28.593，P=0.000)。将采血后24、48、72、96、120 h的CD⁺₄T淋巴细胞定量检测结果分别与采血当日值比较，其中采血后24 h的结果与采血当日值比较差异无统计学意义(P=0.099)， 其他时间检测值较采血当日值的差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。采血后24、48、72、96、120 h的检测结果平均下降了14.583、22.083、49、53.417、88个/μl。

表2 不同保存时间的检测值的统计分析
Table 2 Statistical analysis of detection result at different storage time

参数	24 h	48 h	72 h	96 h	120 h
5 h
F	3.265	9.446	25.424	37.797	41.911
P	0.098	0.011	0.000	0.000	0.000

T淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的一群淋巴细胞，主要由CD⁺₄和CD⁺₈两群细胞组成。CD⁺₄为辅助T淋巴细胞，是HIV感染的最主要靶细胞，其数量和功能的降低是HIV感染引起人体免疫功能缺陷的主要原因。外周血中CD⁺₄ T淋巴细胞的绝对值对于HIV感染状况，疾病分期，预测其机会性感染的可能性和评价治疗效果具有极其重要的作用 。
因此CD⁺₄T淋巴细胞计数是作为直接测定免疫功能的方法，也是反映HIV感染者免疫系统损害状况最明确的指标^[5]。《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册(第2版)》的治疗标准依据也是CD⁺₄T淋巴细胞值。因此CD⁺₄T淋巴细胞检测数据的准确性和可靠性对HIV感染者和对其的管理都非常重要。在现实中，由于检测所需仪器和试剂昂贵且操作复杂等条件限制，病例血样不可能在采集后立即检测，往往都要保存一段时间后统一批量检测，那么保存多长时间不影响检测值是关键。
卢秀杰等^[6]认为同一样本放置8~96 h检测的数据差异<20%，为可接受范围。而本次研究结果认为血样采集后在冷藏条件下，最好在24 h内上机检测，检测结果与采血后立即检测值相同(差异无统计学意义)，若受条件限制，最晚也不要超过48 h，否则，检测结果与真实值有偏差。WHO 1997年发行了CD⁺₄淋巴细胞检测规范，要求在室温条件下检测CD⁺₄T淋巴细胞数时，要在48 h之内完成^[7]。肖瑶等^[8]研究结果提示抗凝全血存放4 ℃也是检测不能超过48 h。以上资料数据与本次研究结果相符。通过这次研究，探索了血样保存的时限，为准确检测CD⁺₄T淋巴细胞提供了参考依据。但本次研究由于检测病例数较少(有12例)，在代表性上有一定局限性，应在以后的研究中扩大样本量再做进一步探索。

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