疾病监测, 2013, 28(1): 17-19
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.1.006
Analysis on suspected cases of thrombocytopenia accompanied by fever in Yantai, Shandong
GONG Lian-feng, LIU Juan, HAN Wen-qing, SUN Zhen-lu, WANG Zhi-yu, GAO Qiao
Yantai Center for Disease Control and Prevention, Yantai 264003, Shandong, China
Abstract
Objective To understand the infection status of novel bunyavirus among suspected cases of thrombocytopenia accompanied by fever in Yantai, Shandong province. Methods The specific nucleic acid of novel bunyavirus were extracted from serum samples of suspected cases of thrombocytopenia accompanied by fever using double probe real-time. Results Among the 135 serum samples, 81 were the specific nucleic acid positive(60.00%). The nucleic acid positive rate was the highest within 5-8 days after onset. The incidence peak mainly occurred during May-August. The cases were distributed in people aged 37-87 years, but the case number in age group 60-70 years was highest(26/81), accounting for 32.10%. Totally 92.59% of the cases were farmers(75/81). The male to female ratio was 1.79:1. Conclusion Thrombocytopenia accompanied by fever caused by novel bunyavirus infection was detected in Yantai.
Keywords:    thrombocytopenia accompanied by fever   novel bunyavirus   nucleic acid detection  

山东省烟台地区发热伴血小板减少综合征疑似病例检测分析
宫连凤, 刘娟, 韩文清, 孙振璐, 王志昱, 高巧
烟台市疾病预防控制中心,山东 烟台 264003
摘要
目的 调查山东省烟台地区发热伴血小板减少综合征疑似病例新型布尼亚病毒(SFTSV)感染情况。 方法 采用双重探针引物实时荧光定量-聚合酶链反应方法对发热伴血小板减少综合征疑似病例血清进行新型布尼亚病毒特异性核酸检测。 结果 135份疑似病例血清样本中新型布尼亚病毒特异性核酸阳性81份,阳性率60.00%。发病第5～8天核酸检出阳性最高;发病高峰主要集中在5-8月;人群年龄分布在37～87岁之间,以60～70岁年龄组发病数最多,占总病例数的32.10%(26/81);92.59%(75/81)的患者为农民;男女性别比为1.79:1。 结论 烟台地区发热伴血小板减少综合征疑似病例存在新型布尼亚病毒感染。
关键词:    发热伴血小板减少综合征   新型布尼亚病毒   核酸检测  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 采集对象
1.2 检测方法
2 结果
2.1 新型布尼亚病毒核酸检测阳性率
2.2 不同发病天数新型布尼亚病毒核酸检测阳性分布情况
2.3 新型布尼亚病毒核酸检测阳性病例的人群分布
2.4 新型布尼亚病毒核酸检测阳性病例的时间分布
2.5 新型布尼亚病毒核酸检测阳性病例的地区分布
3 讨论
　　近年来，在我国山东、安徽、湖北、河南等省，相继发现并报告了以发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病病例，其中少数重症患者可因多脏器损害，救治无效死亡 。为确定该类患者的疾病原因，2010年中国疾病预防控制中心在湖北省、河南省的部分地区启动了发热伴血小板减少综合征病例监测工作。经对患者血液中分离到的病毒进行全基因组序列测定及同源性分析、急性期和恢复期双份血清抗体中和试验等研究，发现了一种属于布尼亚病毒科白 蛉病毒属的新型病毒 。现被命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)，简称新型布尼亚病毒。被认为是发热伴血小板减少综合征病例的致病因子 。自2007年以来，山东省烟台地区也相继报告了类似病例，而且病例呈逐年增多趋势。2011年我们对烟台市发热伴血小板减少综合征疑似病例用实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR)方法进行了实验室诊断，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 采集对象
　　采集烟台市各地医院疑似发热伴血小板减少综合征病例急性期非抗凝血5 ml，及时分离血清，分装保存于-70 ℃冰箱，用于病毒特异性核酸检测。
1.2 检测方法
　　采用双重探针引物FQ-PCR方法检测疑似病例血清中新型布尼亚病毒核酸。核酸提取：由Qiagen 公司提供的 RNeasy Mini Rit(Cat：74104)提取血清中的病毒RNA。具体操作如下：在EP管中加入RLT液 600 μl和 6 μl β-巯基乙醇，加入140 μl血清样本混匀，加入750 μl 70%乙醇充分混匀；将混合液加入柱子，7500×g离心30 s，弃废液；加入700 μl Wash buffer RW1 7500×g离心15 s，弃废液；加入500 μl buffer RPE 7500×g离心，洗2次，弃废液；将柱子置于新EP管，加入40 μl DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水，7500×g离心1 min，收集液即为病毒RNA。实时荧光定量PCR试剂盒：由ABI公司提供的 Ambio AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit(Cat：AM1005)；引物、探针(双重探针分别为FAM-M、Texred-S标记)由中国疾 病预防控制中心病毒病预防控制所提供。引物、探针序列分别为：S-F(5′-GGG TCC CTG AAG GAG TTG TAA A-3′)，S-R(5′-TGC CTT CAC CAA GAC TAT CAA TGT-3′)，M-F(5′-AAG AAG TGG CTG TTC ATC ATT ATT G-3′)，M-R(5′-GCC TTA AGG ACA TTG GTG AGT A-3′);S-Probe-TexasRed(TexasRed-TTC TGT CTT GCT GGC TCC GCG C-BHQ2)，M-Porbe-FAM(FAM-TCA TCC TCC TTG GAT ATG CAG GCC TCA-BHQ1)。用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪扩增。体系配置：扩增体积25 μl，其中包括4.5 μl ddH2O，12.5 μl 2×RT-PCR buffer，S片段、M片段上、下游引物各0.25 μl，Texred-S 0.25 μl，TAM-M 0.25 μl，25×RT-PCR enzyme mix 0.5 μl，RNA模板5 μl。按照50 ℃ 30 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s， 40个循环扩增，60 ℃收集荧光。结果判定Ct值>35.0以上判为阴性。
2 结果
2.1 新型布尼亚病毒核酸检测阳性率
　　共检测发热伴血小板减少综合征疑似病例血清135份，其中新型布尼亚病毒核酸阳性81份，阳性率60.00%。男性83例，阳性52例，阳性率62.65%；女性52例，阳性29例，阳性率21.48%。
2.2 不同发病天数新型布尼亚病毒核酸检测阳性分布情况
　　本病在发病第2天就可检出新型布尼亚病毒核酸阳性，在第15天后检出的可能性很少，在第5～8天检出的病例数较多，见表1。
2.3 新型布尼亚病毒核酸检测阳性病例的人群分布
　　 81例新型布尼亚病毒核酸检测阳性病例中，

表1 不同发病天数新型布尼亚病毒核酸阳性分布
Table 1 Time distribution of novel bunyavirus nucleic acid positive samples
发病天数(d)病例数 构成比(%)
244.94
378.64
456.17
51113.58
61417.28
71417.28
8911.11
956.17
1022.47
1133.70
1233.70
1322.47
1411.23
1511.23


以农民为主，为75例，占92.59%，工人1例，离退人员3例，家务与待业2例；性别分布中男性52例，女性29例，男女性别比为1.79 ∶ 1；年龄最大为87岁，最小为37岁，平均年龄为62.5岁，中位数为62岁，年龄分布见表2。

表2 新型布尼亚病毒阳性病例年龄分布
Table 2 Age distribution of cases infected with novel bunyavirus
年龄组
(岁)		病例数 构成比
(%)		 累计构成比
(%)
≤4033.703.70
41~1113.5817.28
51~2024.6941.98
61~2632.1074.07
71~1619.7593.83
≥8156.17100.00
合计81100.00


2.4 新型布尼亚病毒核酸检测阳性病例的时间分布
　　新型布尼亚病毒阳性病例发病主要集中在5-8月，占总病例数的83.95%(68/81)，在1、2、3、11、12月5个月中无病例发生， 4-10月病例数分别为1例(1.23%)、17例(20.99%)、15例(18.52%)、24例(29.63%)、12例(14.81%)、8例(9.88%)和4例(4.94%)。
2.5 新型布尼亚病毒核酸检测阳性病例的地区分布
　　在烟台市13个县(市、区)中， 只有莱州、蓬莱、海阳、招远、栖霞5个地区有新型布尼亚病毒阳性病例，其中90%的病例集中在莱州(41例)和蓬莱(32例)。其他3个地区病例数分别为海阳3例、招远3例和栖霞2例。
3 讨论
　　多种病原可导致“发热伴血小板减少”，包括病毒性出血热如肾综合征出血热、新疆出血热和登革热等，立克次体类疾病如斑疹伤寒、人埃立克体病及人粒细胞无形体病等，以及严重细菌感染脓毒血症、DIC等。目前临床上很难区分“发热伴血小板减少”症状是由哪种病原引起的，因此实验室诊断显得尤为重要。新型布尼亚病毒是我国新发现引起“发热伴血小板减少综合征”的一种新病毒，该病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，整个基因组包括L片段、M片段和S片段编码区和非编码区基因序列 。目前对此病毒的检测有核酸检测和抗体检测2 种方法，核酸检测具有快速、 灵敏、特异等特点，为新型布尼亚病毒感染的早期确诊方法。本实验选择其S片段和M片段的保守区域为靶序列设计引物探针，采用双重实时荧光PCR方法检测新型布尼亚病毒基因，保证检测结果敏感、可靠。
通过对患者采血检测时间分析，发热伴血小板减少综合征患者在发病第2～15天，血清中均可检出新型布尼亚病毒核酸阳性，约59.26%的病例在发病第5～8天确诊，说明该病发病1周左右时间，患者自觉症状较重而到医院就诊的较多，而发病15 d以后，基本上没有核酸检测确诊病例，可能因为15 d以后病毒血症消失，无法在血清中检测到病毒核酸。
本监测结果显示新型布尼亚病毒感染人群年龄分布在37～87岁之间，患者平均年龄为62.5岁，其中>50岁患者占82.72%，以60~70岁年龄组发病数最多，占总病例数的32.10%；92.59%的患者为农民；男女性别比为1.79 ∶ 1。与李德新[2]的研究结果基本一致。但在年龄分布上与一般病毒性感染疾病侵犯年龄组人群不同，新型布尼亚病毒感染性患者主要为中老年农民，其原因可能是新型布尼亚病毒为蜱传疾病 ，而蜱主要生活在潮湿草地和寄生在牛、羊、犬等动物身上，在农村青壮年大都外出打工，在田间务农劳作的主要为中老年人，故中老年人暴露机会较多，或中老年人身体抵抗力弱免疫力低下对该病毒易感所致。但青壮年、青少年也喜好和宠物(猫、犬)亲昵或到野外玩耍，亦有暴露的机会，却无病例发病，其原因有待进一步研究。
许多病毒可以通过昆虫叮咬而传播，因此被称为虫媒病毒，李德新[2]、Yu等[3]从蜱中检测到新型 布尼亚病毒特异性核酸并分离到病毒，全基因序列分析显示与人感染的病毒为同种病毒，同源性为94%～95%，初步确定蜱为该病的传播媒介。烟台地区新型布尼亚病毒感染始于4月，一直延续到10月，其中83.95% 的病例集中在5-8月，与蜱的活动高峰4-9月相符[4]。与本病多发于春夏季山区农村且人群普遍易感等特点也相符 。本监测结果显示，90%的病例集中在莱州、蓬莱两地，其原因可能为：(1)各种昆虫类传播媒介的生长繁殖区域不断扩大，因此经媒介生物传播疾病的流行规模也不断扩大。莱州、蓬莱为烟台经济较发达地区，人口流动和动植物流通、贸易往来较多，从而促进了虫媒传染病的传播。(2)与莱州、蓬莱的地理流行病学特点有关，均属于丘陵山区地带，家畜放牧和犬类较多。(3)新型布尼亚病毒感染为新发传染病，许多临床医生对此病认识不足，而2008年以后蓬莱、莱州两地医院对此病引起了足够的重视。另外，蓬莱市刘家沟镇古梓庄在2011年8月10日至9月8日发生了5例发热病例，流行病学调查表明此次发生病例聚集的原因可能为人与人之间的传播。提示本病尚有聚集发病的现象，应引起高度重视。

参考文献
[1] Ministry of Health. Fever with thrombocytopenia syndrome Prevention Guide(2010 Edition).. http://www. moh. gov. cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsyjbgs/s3578/201010/49266. htm.(in Chinese) 中华人民共和国卫生部. 发热伴血小板减少综合征防治指南(2010 版) . . http://www. moh.gov. cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsyjbgs/s3578/2010 10/49266. htm.
[2] Li DX. Bunyavirus causing thrombocytopenia accompanied by fever [J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology,2011,25(2):81-84.(in Chinese) 李德新.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒概述[J].中华实验和临床病毒学杂志,2011,25(2):81-84.
[3] Yu XJ, Liang MF, Zhang SY, et al. Fever with Thrombocytopenia Associated with a Novel Bunyavirus in China [J]. N Engl J Med,2011,364(16):1523-1532.
[4] Liu Y, Huang XY, Du YH, et al. Survey on ticks and detection of new bunyavirus in some vect in the endemic areas of fever,thrombocytopenia and leukopenia syndrome(FTLS) in Henan province [J]. Chinese Journal of Preventive Medicine,2012,46(6):500-504.(in Chinese) 刘洋,黄学勇,杜燕华,等.河南发热伴血小板减少综合征流行区蜱类分布及媒介携带新布尼亚病毒状况调查[J]. 中华预防医学杂志,2012,46(6):500-504.