产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)是一种人兽共患的食源性病原体，可引起人类不同程度的肠道疾病，包括水样腹泻和出血性肠炎(HC)，部分患者可发展为死亡率高的溶血性尿毒综合征(HUS)^[1]。自1982年美国首次报道由O157 ∶ H7引起的暴发以来，世界各国相继报道了不同血清型的STEC散发感染和暴发 。目前已发现150多种血清型的STEC能引起人类疾病^[5]，其中仍以O157 ∶ H7血清型为主，但是欧洲和美国的研究报道显示非O157 STEC引起的暴发和散发感染率上升较快，同时相关检测和分子分型技术也表明并非所有非O157 STEC均能引起人类感染。Karmali等^[6]研究表明由STEC引起的疾病谱与血清型和菌株遗传背景有密切关系，某些如O26、O103、O104、O111、O145等血清群菌株曾引起过暴发，而大部分其他非O157 STEC菌株仅引起人类轻微腹泻症状或散发的HUS病例。
STEC的宿主以牛、羊等反刍类动物为主，欧洲研究报道显示健康牛的STEC携带率为10%~50%，健康羊的携带率为36%～67%^[7]，这些动物可作为人类感染的重要传染源。我国目前没有详细的非O157 STEC人感染情况和动物携带情况及菌株特点分析等相关数据报道，但加强非O157 STEC感染的实验室检测和菌株分子流行病特征分析，有助于及时发现暴发疫情，追溯感染来源从而及时控制疫情。美国疾病预防控制中心(CDC)建立了以脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)技术为核心的实验室分子分型监测网络——PulseNet，并正在发展多位点可变数目串联重复序列分析 (variable-number tandem repeats) analysis，MLVA]的第二代监测技术，其中有些病原菌如STEC O157 ∶ H7的MLVA分型方案已经建立^[8]。Lindstedt等^[9]筛查了一些新的VNTR位点，建立了能用于EIEC、ETEC、EPEC、EAEC、STEC及志贺菌分型分析的MLVA方法。本研究对分离自我国不同地区、不同宿主来源以及不同血清型和毒力基因特征的STEC分离株进行了MLVA分析，初步探讨了该方法的分型能力、我国STEC分离株的分子流行病学特征，为包括非O157 STEC在内的监测和防控提供分子流行病学依据。 1.1 材料
1.1.1 菌株来源
　　本研究中70株STEC代表性菌 株分别分离自腹泻患者粪便(8株)、羊粪(25株)、牦牛粪(18株)、猪粪或猪肠内容物(14株)、肉牛粪(4株)以及鸡粪(1株)，其中O157 ∶ H7菌株13株，均为国家监测点的监测菌株，非O157 STEC菌株57株，均为本实验室分离。菌株分离时间跨度为1988-2012年，标本来源地包括北京、天津、江苏、河南、山东、湖南、四川、黑龙江、青海、贵州等。所有菌株经API 20E生化条鉴定为大肠埃希菌，血清型鉴定使用丹麦血清研究院(Statens Serum Institut, Denmark)和天津生物芯片有限公司生产血清套装，鉴定步骤按照说明书进行。多重PCR方法对菌株进行stx₁/stx₂毒力基因检测^[8]。参考菌株为STEC O157 ∶ H7 EDL933。
1.1.2 主要试剂与仪器
　　细菌基因组提取试剂盒(Bacteria Gene DNA kit)购自康为世纪公司。Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、dNTPs 及DL2000 DNA Marker购自大连TaKaRa公司；PCR仪(SensoQuest Labcycler)购自德国Senso公司。
1.2 方法
1.2.1  细菌基因组DNA制备及引物合成
　　严格按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA模板，置-20 ℃保存备用。根据参考文献^[10]，合成CVN001、CVN002、CVN003、CVN004、CVN007、CVN0014、CVN0015 共7个VNTR位点的引物，并在上游引物5′末端标记相应荧光报告基团，见表1。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 7个VNTR位点的引物序列、重复序列长度和重复序列数目(O157 ∶ H7 EDL933为参考菌株)信息表
Table 1 Primer sequences, repeat length and copy numbers in E. coli O157 ∶ H7 EDL933

引物名称	引物序列	重复序列长度(bp)	重复序列数目
CVN001-F	5′-HEX-AAC CGG CTG GGG CGA ATC C-3′	39	6
CVN001-R	5′-GGC GGC GGT GTC AGC AAA TC-3′
CVN002-F	5′-TET-AAC CGT TAT GAA RGR AAG TCC T-3′	18	12
CVN002-R	5′-TCG CCC AGT AAG TAT GAA ATC-3′
CVN003-F	5′-6FAM-AAA AAT CCG GAT GAG WTG GTC-3′	15	2
CVN003-R	5′-TTG CGT TGT CAG TAA TTT GTT CAG-3′
CVN004-F	5′-HEX-MGC TGC GGC RCT GAA GAA GA-3′	15	3
CVN004-R	5′-CCC GGC AGG CGA AGC ATT GT-3′
CVN007-F	5′-6FAM-ACC GTG GCT CCA GYT GAT TTC-3′	18	4
CVN007-R	5′-ACC AGT GTT GCG CCC AGT GTC-3′
CVN014-F	5′-6FAM-TCC CCG CAA TCA GCA AMA CAA AGA-3′	6	4
CVN014-R	5′-GCA GCR GGG ACA ACG GAA GC-3′
CVN015-F	5′-TET-TAG GCA TAG CGC ACA GAC AGA TAA-3′	6	3
CVN015-R	5′-GTA CCG CCG AAC TTC AAC ACT C-3′

1.2.2 目的VNTR位点PCR扩增
　　采用聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增各VNTR位点，PCR反应采用4个反应体系，体系一包括：10×buffer 2.0 μl、dNTP 0.125 μmol/L、CVN001和CVN003上、下游引物各0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.25 μl (1.25 U)、DNA模板1 μl，补充蒸馏水至20 μl；体系二包括引物CVN004和CVN014；体系三包括CVN007和CVN015，体系四包括CVN002，引物浓度和PCR体系均同体系一。PCR 循环条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，体系一、二、三采用63 ℃退火45 s，体系四 50 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
1.2.3  PCR扩增产物的检测与分析
　　PCR扩增产物送北京擎科生物技术有限公司，采用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用GeneScan 600 Liz DNA marker对扩增产物的大小进行校准和确认，GeneMapper v4.0分析软件进行片段大小分析，根据各位点片段大小计算各位点的重复次数，使用 BioNumerics (Version 4.0)分析软件进行聚类分析。 2.1 VNTR 各位点多态性分析
　　本研究中CVN001、CVN002、CVN003、CVN004、CVN007、CVN0014、CVN0015共7个VNTR位点在13株STEC O157 ∶ H7菌株中的重复序列数目分别为1、3、2、2、2、5、2；在57株非O157 STEC菌株中重复序列数目分别为8、4、4、6、1、17、1。位点CVN002在2株菌中没有扩增，位点CVN003在36株菌中没有扩增，分别以np(no product)表示，排除PCR扩增问题，认为这两个位点在本研究部分菌株中不存在或消失。由此可见CVN001在本实验中的13株STEC O157 ∶ H7菌株中没有多态性，CVN007 和CVN0015在57株非O157 STEC菌株中没有多态性，其余位 点在70株菌中均呈现较好多态性，尤其是CVN014在STEC O157 ∶ H7和非O157 STEC中均呈现最多的重复序列数目，应成为后续进一步完善MLVA方法时的候选位点。

2.2 MLVA分型分析
　　根据7个VNTR位点重复序列拷贝数，70株STEC菌株共分为46个MLVA型别，分别命名为MLVA1~MLVA46。进一步以BioNumerics软件对VNTR位点的拷贝数进行聚类分析，结果显示70株STEC菌株可分为明显的两个群(A、B)，13株STEC O157 ∶ H7菌株均位于A群，57株非O157 STEC菌株均位于B群。B群菌株可进一步分为8个亚群，分别为B1~B8，其中B1占22.8%(13/57)，B2占52.6%(30/57)，B3~B8占24.6%(14/57)，见图1。上述结果表明70株STEC代表性菌株具有较好的VNTR多态性，7个位点的VNTR方法，可以很好地区分O157与非O157 STEC菌株。
2.3 不同MLVA型别菌株的血清型情况
　　本研究中70株STEC菌株涵盖28种O ∶ H血清型，O157血清型与非O157血清型菌株分别为两个独立的克隆群。在27种非O157血清型菌株中，共有38种MLVA型别，某些相同血清型如O149 ∶ H45的菌株具有相同的MLVA型别；相同血清型如O103 ∶ H8、O21 ∶ H25，其中有的菌株为相同的MLVA型别，有的则属于不同的MLVA型别；有些不同血清型如O20 ∶ H30、O100 ∶ H20、O172 ∶ H30的菌株属于相同的MLVA型别。提示MLVA在区分非O157 STEC菌株的血清型方面，具有一定的区分能力，但也存在一定的局限性。
2.4 不同MLVA型别菌株携带志贺毒素基因情况
　　 70株STEC分离株中，stx₁基因阳性的20株，stx₂基因阳性的34株，stx₁+stx₂基因均阳性的16株。志贺毒素基因类型与MLVA型别存在一定的相关性。除MLVA型别10、20、30存在不同志贺毒素类型的菌株外，其余所有相同MLVA型别的菌株志贺毒素类型相同。
2.5 不同宿主来源STEC菌株的MLVA分型情况
　　 本研究中STEC菌株分离自腹泻患者和5种不同动物宿主，13株O157 ∶ H7菌株中人源菌株可与多种动物源菌株分为相同型别。57株非O157 STEC菌株中，2株人源菌株单独属于B6亚群；11株(11/18，61.1%)牦牛菌株属于B1亚群，其余7株属于B2、B3、B5亚群；17株(17/23，73.9%)株羊源菌株属于B2亚群，其余6株属于B3、B4、B5、B7亚群；13株(8/13，61.5%)株猪源菌株属于B2亚群，其余5株属于B1、B5、B8亚群。B2优势群中羊源菌株占56.7%(17/30)，其次是猪源菌株占26.7%(8/30)。不同宿主来源菌株与MLVA型别存在明显的关联，除MLVA型别20、30存在不同宿主来源的菌株外，其余所有相同MLVA型别的菌株均具有相同的宿主来源，提示MLVA方法具有一定的菌株溯源能力。

图1 产志贺毒素大肠埃希菌分离株MLVA聚类图
Figure 1 Dendrogram of MLVA results for Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates
　　近年来国际上报道非O157 STEC 感染率不断上升，许多国家甚至出现了非O157 STEC暴发 ，特别是2011年德国暴发大规模STEC O104 ∶ H4感染^[13]。1999年我国苏皖地区暴发了O157 ∶ H7感染^[14]，随后我国在这些地区开展了O157 ∶ H7的监测，而非O157 STEC在我国的感染情况目前尚未开展系统工作，但我们仍应对非O157 STEC感染予以重视。
美国CDC建立的以PFGE技术为核心的实验室分子分型监测网络——PulseNet，已经成功处置和预警了多起细菌性传染病暴发疫情。目前有的病原菌如O157 ∶ H7已经发展了基于MLVA的第二代分子分型技术，有的病原菌MLVA技术仍在建立中。MLVA分型技术是依据不同菌株间细菌基因组中存在着VNTR位点拷贝数差异进行分子分型，具有分型能力强、简便、快速、稳定、数据交流便利等优点，可以识别暴发菌株，在细菌性传染病溯源及监测预警中可发挥重要作用。
本研究利用文献报道的针对不同致泻性大肠埃希菌和志贺菌的7个VNTR位点，对我国不同地区、不同宿主来源、不同血清型和毒力基因特点的代表性菌株进行了分析，该方案能很好的区分O157与非O157 STEC菌株。在区分非O157 STEC菌株方面，该方案能较好的区分不同血清型、不同志贺毒素类型以及不同动物来源的菌株。但仍有少部分血清型、志贺毒素类型和宿主来源不同的菌株未能被区分。分析这7个VNTR位点，少数位点对分析菌株的多态性有限，2个位点在部分菌株中无扩增产物。因此在应用该方案对暴发菌株进行溯源分析时，在条件允许的情况下，可进一步结合其他分型方案如PFGE，以做出更为准确的判断。同时，在目前GenBank等公共数据库中有越来越多STEC菌株测序基因组信息的情况下，可发掘新的更有区分能力的VNTR位点，进一步提高MLVA的分辨率，从而提高其对菌株甄别、暴发溯源等的应用价值。

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