腹泻病是世界范围内最常见的疾病之一，而A组人轮状病毒是引起婴幼儿重症腹泻的最主要病原体。几乎所有儿童在5岁前都感染过轮状病毒(Rotavirus, RV)，全球每年约44～60万儿童因轮状病毒腹泻而死亡^[1]，严重影响儿童的身体健康和成长发育。
使用基因分型方法，可将A组轮状病毒分为G血清型、P基因型。G血清型包括G1~G16，P基因型可分为28个亚型。
G血清型优势流行株可在一个地区占主导地位流行多年，但均以G1~G4为主，G9型作为优势流行株在世界的不同国家已有报道，但中国至今还没有关于G9型作为优势流行株的报道。
内蒙古腹泻病监测点是中国大陆17个腹泻病监测点之一，同时是世界卫生组织(WHO)经2年连续考核优秀的WHO轮状病毒参比实验室。从2008年开始对内蒙古妇幼保健哨点医院采集的粪便标本进行检测，分析监测数据，为本地区制定腹泻病防控措施提供依据，及时发现新病原或起重要作用病原。为全国的腹泻病控制提供参考资料，为中国轮状病毒疫苗的优势亚型构成提供理论依据，便于按年度变化进行疫苗亚型的合理构成，并实现轮状病毒感染水平呈下降趋势的监测目标。通过几年的研究，发现呼和浩特地区由轮状病毒引起腹泻病的优势亚型发生了从G1到G3^[2]，再从G3到G9的变化。本文对2010年7月至2012年6月间采集的腹泻粪便标本进行的轮状病毒G、P分型，亚型组合型别及亚型G3到G9 变化的检测结果进行报道。 1.1 研究对象
　　 2010年7月至2012年6月共采集腹泻患儿的标本789份。腹泻患儿特征：每日排便(>3次)且大便性状发生明显改变(包括稀水样、蛋花样、黏液样或稀糊样等)。采样每份样本为5~10 ml，置于清洁干燥无菌粪便采样杯内，贴上带有唯一识别号码的标签，-20 ℃冻存。对所有5岁以下腹泻患儿使用统一的“腹泻病例个案表”进行调查，经患儿家长知情同意后采用面对面现场询问获得信息。
1.2 试验方法
1.2.1 标本的处理
　　制备10％的粪便悬液：将粪便标本加到1.5 ml EP管中，加入标本处理液，振荡3次，每次10 s。然后静置10 min，再以8000 r/min离心5 min，吸取上清进行下一步试验。
1.2.2  酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RV抗原
　　 采用英国OXOID公司IDEIA^TM Rotavirus试剂盒，按照说明书中步骤操作：在试剂盒96孔板中每孔加入100 μl离心后的上清及阴、阳性对照，然后每孔加酶结合物100 μl，室温放置1 h，将液体倒掉，洗液洗板5次，拍干液体，加显色液100 μl，作用10 min，再加终止液10 min内测定A₄₅₀值。临界值为阴性对照A₄₅₀值＋0.20，大于临界值判为阳性，小于临界值判为阴性，临界值±0.01范围内判为可疑，重复检测。
1.2.3  轮状病毒RNA提取
　　采用Geneaid Biotech 公司Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ试剂盒，按照说明书步骤操作。将200 μl 10％粪便悬液加入EP管中。加400 μl VB Lysis Buffer 至已加入粪便悬液的EP管中，vortex 混匀。室温(15～25 ℃)孵育10 min。将VB柱子放入2 ml收集管中。加450 μl的AD Buffer至上述样本溶解物中，vortex 混匀。打开VB柱盖子，将600 μl溶解混合物移至VB柱子中, 13 000 r/min离心1 min。弃去滤过液，仍将柱子放入原收集管中。打开VB柱盖子，将剩余的样本溶解混合物移至VB柱子中，13 000 r/min离心1 min。弃去收集管，将VB柱子放入另一新的收集管中。加400 μl W1 Buffer 至VB柱子中，13 000 r/min离心30 s。弃去滤过液，仍将柱子放入原收集管中。加600 μl的 Wash Buffer 至VB柱子中，13 000 r/min离心30 s。弃滤过液。13 000 r/min，离心空柱子3 min。将干燥的VB柱放入干净的1.5 ml EP管中。弃收集管。打开VB柱盖子，加50 μl RNase-free 水至VB柱中进行洗脱，室温孵育3 min，13 000 r/min离心1 min。病毒DNA进行聚合酶链反应(PCR)。
1.2.4 巢式-反转录聚合酶链式反应(nested RT-PCR)
　　将ELISA检测阳性标本提取核酸，以病毒cDNA为模板,进行G/P分型。采用WHO推荐编码VP7基因型，VP4基因型的保守序列设计引物。并根据基因内不同基因型特征序列设计分型引物进行基因扩增，扩增设阴阳性对照。G血清分型及P基因分型扩增反应条件:
核酸变性:98 ℃变性5 min；反转录及第1次PCR扩增: 50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min，(94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s)×35次循环，72 ℃ 7 min；第2次PCR扩增:94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s)×35次循环，72 ℃ 7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪中根据电泳带分子质量大小判定轮状病毒G、P亚型。dNTP, ExTaq DNA Polymerase购自宝生物工程(大连有限责任公司)，引物由中国疾病预防控制中心提供。
1.2.5 实验室质量控制措施
　　在P2实验室生物安全柜中进行便样的样本处理及提取病毒核酸，严格按照生物安全要求进行操作。ELISA实验中设立阴阳性对照，PCR实验中设立阳性对照及核酸提取阴性对照、第1次扩增及第2次扩增阴性对照。
1.3 统计学分析
　　建立EpiData数据库录入调查问卷并进行核对，采用SPSS 13.0统计软件，进行统计分析。计数资料比较使用χ²检验，检验水准为0.05。 2.1 流行病学特征
2.1.1 轮状病毒感染情况
　　2010年7月至2012年6月共采集≤59月龄的住院腹泻患儿粪便标本789份，ELISA检测阳性288例，阳性率为36.50%。2010年7月至2011年6月阳性率为37.50%(141/376)，2011年7月至2012年6月阳性率为35.59%(147/413)。2年比较差异无统计学意义(χ²=0.617，P=0.432)。
2.1.2 性别分布
　　2010年7月至2012年6月男性患儿RV阳性率37.35%(186/498)，女性患儿RV阳性率35.05%(102/291)。男女患儿阳性率差异无统计学意义(χ²=0.418，P=0.518)。患儿男女性别比为1.82 ∶ 1。
2.1.3 地区分布
　　2010年7月至2012年6月城市患儿RV阳性率35.50%(186/524)，乡村患儿RV阳性率38.49%(102/265)。城、乡患儿阳性率差异无统计学意义(χ²=0.681，P=0.409)。城市患儿数 ∶ 乡村患儿数=1.82 ∶ 1。
2.1.4 时间分布
　　10月至次年2月阳性率较高，其中12月阳性率最高，2010年12月达68.57%，2011年12月达51.28%，见图1。

图1 2010-2012年呼和浩特市5岁以下腹泻住院患儿轮状病毒季节分布
Figure 1 Time distribution of rotavirus infections in children aged ＜5 years in Hohhot， 2000-2012
2.1.5 月龄分布
　　不同月龄组两两比较，检验水准为0.0083，0~与6~月龄： χ²=13.135，P=0.0002； 0~与12~月龄： χ²=29.755，P<0.001；0~与24~月龄: χ²=0.244， P=0.622；6~与12~月龄： χ²=5.914， P=0.015；6~与24~月龄： χ²=1.951， P=0.162；12~与24~月龄：χ²=6.853， P=0.009。12~23月龄组感染率最高，为50.00%，2岁以下患儿占全部患儿总数的95.83%。整体比较χ²=31.745，P<0.001,见表1。
2.2 轮状病毒G、P血清型分型结果
　　对288份轮状病毒抗原阳性标本进行PCR检测，其中G血清型

表1 不同月龄组患儿RV检测结果
Table 1 Age specific results of rotavirus detection in diarrhea children

月龄	检测例数	RV
		阳性例数	阳性率/%
0~	238	58	24.37
6~	324	126	38.89
12~	184	92	50.00
24~	43	12	27.91
合计	789	288	36.50

分出亚型的有268份，占93.06%,P基因型分出亚型的有227份，占78.82%。同一份标本G、P亚型均分出型别的有220份，占76.39%。G、P亚型电泳条带位置见表2、图2～4。 　　呼和浩特市2010年7月至2012年6月轮状病毒年检率为36.50%,年检率高于2009 2010年湖南省(22.79%)检出率^[3]、2007 2009年天津市(32.2%)检出率^[4]及长春地区(35.22%)检出率^[5]，低于兰州市及河北省(54.7%~64.0%)的报道^[6]。本次研究的24个月中10月至次年2月阳性率较高，而2012年4月阳性率稍有增高现象，与2009年4月相似^[2]。4月是否为轮状病毒发病的小高峰，有待于今后的监测加以验证。
对月龄的分析显示：12~23月龄组感染率最高50.00%，与中国其他地区的研究结果相似 。各月龄组进行统计学比较：只有0~与6~月龄组与0~与12~月龄组差异有统计学意义。2岁以下患儿占全部患儿总数的95.83%，广西监测点为96.11%^[10]。

表1 2010年7月至2012年6 月 RV阳性标本中病毒基因亚型比例分布
Table 1 Distribution of rotavirus genotype in antigen positive samples, July 2010-June 2012

血清型	P[8]			P[4]			P[6]			P[9]			P[8]P[1]			P[8]P[4]			未分型			合计
	例数	构成比/%		例数	构成比/%		例数	构成比/%		例数	构成比/%		例数	构成比/%		例数	构成比/%		例数	构成比/%		例数	构成比/%
G1	8	2.8		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		1	0.3		6	2.1		15	5.2
G2	5	1.7		12	4.2		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		17	5.9
G3	37	12.8		5	1.7		0	0.0		0	0.0		1	0.3		7	2.4		18	6.3		68	23.6
G4	1	0.3		2	0.7		1	0.3		0	0.0		0	0.0		1	0.3		0	0.0		5	1.7
G9	83	28.8		6	2.1		0	0.0		0	0.0		0	0.0		8	2.8		8	2.8		105	36.5
G1G3	15	5.2		1	0.3		0	0.0		1	0.3		0	0.0		4	1.4		13	4.5		34	11.8
G2G3	8	2.8		2	0.7		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		10	3.5
G2G9	0	0.0		1	0.3		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		1	0.3
G3G9	7	2.4		1	0.3		0	0.0		0	0.0		0	0.0		2	0.7		3	1.0		13	4.5
未分型	5	1.7		2	0.7		0	0.0		0	0.0		0	0.0		0	0.0		13	4.5		20	6.9
合计	169	58.7		32	11.1		1	0.3		1	0.3		1	0.3		23	8.0		61	21.2		288	100.0

图2 2011年7月至2012年6月轮状病毒G9型构成情况
Figure 2 Proportion of rotavirus G9 detected, July 2011-June 2012

图3 2%琼脂糖凝胶电泳显示RV不同G血清型扩增条带
Figure 3 Amplification of rotavirus of different serotype G by 2% agarose gel electrophoresis    注： M：100 bp ladder marker；1~8为检测样本；9为G3阳性对照；10为G1阳性对照；11~13为阴性对照。ELISA检测阳性样本为1、2、5、7、8, ELISA检测阴性样本为3、4、6。经RT-PCR检测：1为G1型；2、5为G2型；7为G3型；8为G9型；3、4、6为阴性。

图4 2%琼脂糖凝胶电泳显示RV不同P基因型扩增条带
Figure 4 Amplification of rotavirus of different genotype P by 2% agarose gel electrophoresis   注： M：100 bp ladder marker；1~8为检测样本；9、10为P[8]阳性对照；11~13为阴性对照。ELISA检测阳性样本为1、2、5、7、8，ELISA检测阴性样本为3、4、6。经RT-PCR检测：1、7为P[8]型；2为P[4]型；5、8为P[6]型； 3、4、6为阴性。

乌鲁木齐市为94.7%^[11]。因此有必要定期对<2岁婴幼儿RV感染高危人群进行健康教育及消毒。<2岁婴幼儿也应作为疫苗实施的重点人群。
对于G分型，G9型在我国于1994年首次报道^[12]，目前已成为全球第4位常见流行株，占4.1%^[13]。2008 2009年在内蒙古地区首次检出1例G9型后^[7]，2009年6月至2010年5月检出9例^[2]，本次研究显示，2010年7月至2011年6月，G9型占4.3%(6/141)；2011年7月至2012年6月，G9型占67.3%(99/147)， 2011年12月至2012年6月，G9型已占82.8%(82/99)。而G3型从37.6%降低到10.2%。在呼和浩特地区2008 2010年G血清型的优势亚型由G1型变为G3型^[2]，而2010 2012年G血清型的优势亚型又由G3型变为G9型，并显示出G9型作为流行优势株的主要地位。在2011年病毒性腹泻监测工作总结会议上，全国17个监测点中，仅内蒙古自治区及河北省监测到了G9型增高的趋势。因此，由2011年起呼和浩特地区进入G9的流行期，G9型作为优势流行株在呼和浩特将持续多长时间，有待于进一步的监测和研究。G9型是否已开始成为中国大陆地区的流行优势株，也需要进一步的监测。
对于P分型，我国最常见的P基因型为P[8]和P[4]^[14]，组合常见型为G1P[8]、G3P[8]型。本次研究显示：P[8]型在呼和浩特地区仍占绝对优势。
文献显示，G9血清型多与P[8]基因型相结合^[15]。本研究结果表明，2010 2011年主要的组合型为G3P[8]型,占19.1%(27/141)，2011 2012年主要的组合型为G9P[8]型，占55.1%(81/147)。
由于轮状病毒腹泻发病率高且危害大，疫苗是唯一可行的预防和控制其发病率及病死率的医疗手段^[16]。因此，研究RV的流行病学及基因亚型特点，有利于新疫苗成分的确定，进而降低RV发病率，提高易感儿童的生活质量，有效遏制轮状病毒性腹泻在人群中的暴发。
笔者的监测结果证实：G9型已成为近两年呼和浩特市轮状病毒的绝对优势型，G9型能否成为今后中国大陆的绝对优势型，还需要其他监测省份的监测结果加以证实，中国大陆地区的整体监测结果将对新疫苗成分的确定有重要的参考意义。

	扩展功能
	本文信息
	PDF全文
	HTML全文
	参考文献
	服务与反馈
	把本文推荐给朋友
	加入我的书架
	加入引用管理器
	引用本文
	Email Alert
	本文作者相关文章
	贾铮
	郭卫东
	李春英
	PubMed
	Article by JIA Zheng
	Article by GUO Wei-dong
	Article by LI Chun-ying