疾病监测, 2013, 28(9): 726-729
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.9.009
Surveillance of leptospirosis in Quzhou, Zhejiang, 2001-2012
WANG Min, YU Zhang-you, JIANG Xian-chen, ZHANG Xing
Quzhou Center for Disease Control and Prevention, Quzhou 324000, Zhejiang, China
Abstract
Objective To investigate the epidemiological characteristics of leptospirosis in Quzhou, Zhejiang province, from 2001 to 2012, and provide scientific evidence for the prevention and treatment of leptospirosis. Methods Descriptive epidemiological analysis was conducted on the incidence data of leptospirosis in Quzhou during this period. The serum antibody detections of the diagnosed patients and host animals were conducted with microscopic agglutination test. The kidneys of mice, frogs, ducks and pigs as well as the mid stream urine of cattle were collected for the pathogen isolation. The kidneys of mice and frogs were collected to detect leptospira with PCR. Results The average annual incidence of leptospirosis in Quzhou was 0.27/lakh from 2001 to 2012. The disease mainly occurred in summer and autumn. Most cases were middle-aged farmers, and more cases occurred in males than in females. The serological detection indicted that the major pathogen in the patients was L. icterohemorrhagie. The positive rate of pathogen detection in host animals was 0.56%, the major pathogens were L. icteroheamorrhagiae and L. autumnalias. The serum positive rate was 17.79% in host animals, the major pathogens were L. icteroheamorrhagiae (50.00%) and L. autumnalias (28.30%). Conclusion Close attention still should be paid to the prevention and treatment of leptospirosis in Quzhou, especially after flood disaster. It is necessary to strengthen the surveillance of leptospirosis both in human and in host animals.
Keywords:    leptospirosis   surveillance   epidemiology  

2001-2012年浙江省衢州市钩端螺旋体病监测分析
王敏, 余樟有, 姜宪尘, 张幸
衢州市疾病预防控制中心, 浙江 衢州 324000
摘要
目的 了解浙江省衢州市钩端螺旋体(钩体)病疫情流行特征,为制定防治对策提供参考依据。 方法 用描述性流行病学方法对衢州市2001-2012年钩体病流行特征进行分析,用显微镜凝集试验,对临床确诊病例和宿主动物血清进行抗体测定;采集鼠、蛙、鸭、猪肾和牛中段尿,进行病原体分离培养;采集鼠、蛙肾进行钩体聚合酶链反应监测。 结果 衢州市2001-2012年钩体病年平均发病率为0.27/10万,发病以夏秋季为高发季节,以青壮年农民为主,男性高于女性,病例血清分型以黄疸出血群为主;宿主动物病原学监测阳性率为0.56%,以黄疸出血群和秋季热群为主;宿主动物血清抗体阳性率为17.79%,以黄疸出血群及秋季热群为主,分别占50.00%和28.30%。 结论 衢州市钩体病防治工作仍然不能放松,在洪涝灾害后,应列为防制重点,并继续加强对宿主动物和人群的监测,注意菌群变动。
关键词:    钩端螺旋体   流行病学   监测  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 人间疫情监测
1.2 疫源地监测
1.3 血清学监测
1.4 钩体分离培养
1.5 动物血清抗体监测
1.6 PCR检测
1.6.1 主要试剂
1.6.2 PCR扩增引物
1.6.3 鼠肾和蛙肾标本DNA的提取
2 结果
2.1 疫情概况
2.2 时间分布
2.3 地区分布
2.4 人群分布
2.5 钩体病患者血清抗体测定
2.6 宿主动物监测
2.6.1 鼠密度监测
2.6.2 宿主动物带菌监测
2.6.3 宿主动物血清抗体监测
2.6.4 宿主动物聚合酶链反应(PCR)监测
3 讨论
　　钩端螺旋体(钩体)病是由钩端螺旋体属的不同血清型致病性钩体引起的一种人兽共患病，以鼠类、猪和牛等为主要传染源。浙江省衢州市1960年首次报告该病，是浙江省钩体病的主要疫源地之一[1]。衢州市历年均开展了以人间疫情、疫源地宿主动物带菌率、菌群变化等为主的钩体病监测，现将2001 2012年监测结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 人间疫情监测
　　全市各医疗单位按照传染病诊断标准进行报告，对所有现症患者采集急性期和恢复期静脉血各一份3～5 ml进行血清学核实。
1.2 疫源地监测
　　在龙游县溪口镇、常山县青石乡、江山市清湖镇等历史流行乡镇, 采用夹夜法每年8 10月野外捕鼠计算密度，鉴定鼠种；用背式法解剖，无菌取猪、鼠、蛙、水鸭的双肾以及牛中段尿等分离培养钩体；采集水鸭及青蛙血清进行抗体监测；采集部分鼠肾、蛙肾进行钩体PCR检测。
1.3 血清学监测
　　患者血清学监测采用国内标准菌株15群15型以显微镜凝集试验(MAT)测定血清抗体，凡双份血清抗体滴度呈4倍以上增高或单份血清效价≥1 ∶ 400者判定为阳性[2]。
1.4 钩体分离培养
　　病原体分离培养采用8%兔血清磷酸盐缓冲液,即Kothorf 培养基，检材观察时间为90 d，分离出菌株及时传代定群，然后送浙江省疾病预防控制中心(CDC)鉴定。
1.5 动物血清抗体监测
　　采用MAT检测抗体，将15群标准血清分别用生理盐水稀释成1 ∶ 25 ( 2.4 ml 生理盐水加0.1 ml血清混匀)；用移液器将已稀释的分群标准血清50 μl，分别加入到有机玻璃反应板第1列的15个凹孔内，用PBS倍比稀释成1 ∶ 100，1 ∶ 200等不同稀释度，每孔再用移液器吸取待检菌株50 μl (凹孔内最终浓度为稀释度的2倍)。将反应板置振荡器上摇匀，37 ℃ 2 h(或22～37 ℃振荡20 min)。用接种环挑取凹孔内反应物于载玻片上暗视野镜检，观察有无凝集现象。以出现++凝集(即视野中50%钩体凝集)为终点滴度，以最高稀释度的血清群别报告，血清抗体≥1 ∶ 20判定为阳性[1]。
1.6 PCR检测
　　采集监测点部分鼠肾、蛙肾标本采用PCR进行检测。
1.6.1 主要试剂
　　Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp Marker、琼脂糖及由宝生物工程(大连)有限公司提供的TaKaRa细菌和DNA提取试剂盒。
1.6.2 PCR扩增引物
　　上游引物序列为：5′-TGA ATC GCT GTA TAA AAG T-3′，下游引物序列为:5′-GGA AAA CAA ATG GTC GGA AG-3′。
1.6.3 鼠肾和蛙肾标本DNA的提取
　　用TaKaRa组织基因组试剂盒提取钩体DNA。菌株鉴定及血清抗体检测所用诊断血清和钩体国内标准菌株15群15型由浙江省CDC提供，并在浙江省CDC 实验室人员指导下完成。
2 结果
2.1 疫情概况
　　2001 2012年全市共报告钩体病78例，年平均发病率为0.27/10万，无死亡病例报告。发病数历年总体呈逐年下降趋势，2001 2004年共发病67例，占总发病例数的85.90%，基本呈直线下降趋势；2005 2012年共发病11例，占总发病例数的14.10%，发病处于稳定水平，见表1。
2.2 时间分布
　　钩体病的发病呈明显的季节性，78例病例发病时间主要集中在7 10月，共76例，占总发病例数的97.44%；6月报告2例，其余各月份均无病例报告，见表1。

表1 2001-2012衢州市钩体病发病情况
Table 1 Incidence of leptospirosis in Quzhou, 2001-2012
年份病例数构成比/%月份病例数构成比/%
20013646.15100.00
20021823.08200.00
200378.97300.00
200467.69400.00
200522.56500.00
200611.28622.56
200722.5672633.33
200822.5681924.36
200911.2891519.23
201011.28101620.51
201122.561100.00
201200.001200.00
合计78100.00合计78100.00


2.3 地区分布
　　钩体病发病在全市6个县(市、区)的地区分布差异较大，病例主要分布在江山市、龙游县及常山县，发病数分别占总发病例数的34.62%、33.33%、23.08%，3个县市发病数共占总发病例数的91.03%，开化县和衢江区发病数分别占5.13%和3.85%，柯城区无病例报告。
2.4 人群分布
　　钩体病发病在性别分布中，男性48例，占61.54%，女性30例，占38.46%，男女性别比为1.60 ∶ 1；在年龄分布中，患者年龄最小的为12岁，最大的为78岁，病例以25~54岁的青壮年为主，占70.51%；在职业分布中，农民发病数74例，占94.88%，其余2例学生，工人和干部职员各1例，见表2。

表2 2001-2012年衢州市钩体病患者性别、年龄、职业分布
Table 2 Gender, age and population distributions of leptospirosis cases in Quzhou, 2001-2012
分组 钩体病发病情况
发病人数 构成比/%
性别
 男性4861.54
 女性3038.46
年龄组(岁)
  5~56.41
 15~78.97
 25~2025.64
 35~2329.49
 45~1215.38
 55~78.97
 65~33.85
 75~11.28
职业
 农民7494.88
 工人11.28
 学生22.56
 干部职员11.28


2.5 钩体病患者血清抗体测定
　　2001 2012年共采集现症钩体病患者血清51份，MAT阳性22份，阳性率43.13%，血清群中黄疸菌群11份，占50.00%；七日热群9份，占40.91%；秋季热群及流感伤寒群各1份，分别占4.55%。
2.6 宿主动物监测
2.6.1 鼠密度监测
　　2001 2012年在历史老疫区龙游县溪口镇、常山县青石乡、江山市清湖乡设立3个监测点，采用夹夜法测定鼠密度。在野外共布放有效鼠夹72 107只，捕鼠3645只，平均鼠密度为5.05%，鼠种最多3种依次为黑线姬鼠50.22%(1740/3465)、褐家鼠18.52%(675/3465)、小家鼠16.54%(603/3465)，3种鼠种共占总鼠种的87.10%，见表3。

表3 2001-2012年衢州市钩体病监测点野外鼠密度及鼠种分布
Table 3 Density and species of mice in surveillance area in Quzhou, 2001-2012
地区 有效布夹数 捕获数 鼠密度/% 鼠种分布
黑线姬鼠 褐家鼠 小家鼠 黄毛鼠 黄胸鼠 臭鼩鼱 社鼠 针毛鼠 其他鼠种(1)
龙游县25 96013465.18112821607811572718
常山县29 90211083.7132919949145062405
江山市16 24511907.3328345510625449172007
合计72 10736445.051740675603258177341012730
  注：(1)包括灰麝鼩、大足鼠、巢鼠、白腹巨鼠、中华姬鼠、黄鼬、竹鼠等。


2.6.2  宿主动物带菌监测
　　2001 2012年在3个监测点共培养鼠肾、猪肾、鸭肾、青蛙肾、牛中段尿5类标本10 078份，分离到钩体菌株56株，总阳性率为0.56%，以鼠类的带菌率最高，为1.14%，与其他类标本带菌率相比，差异有统计学意义(χ2=33.00， P<0.001)；菌群包括黄疸出血群、秋季热群和七日热群共3种，优势菌株为黄疸出血群，占51.79%(29/56)，其次为秋季热群，占46.43%(26/56)，见表4。

表4 2001-2012年衢州市钩体病动物带菌监测情况
Table 4 Surveillance result of leptospirosis in host animals in Quzhou, 2001-2012
标本类型 标本份数 阳性份数 阳性率/% 鉴定结果
黄疸出血群 秋季热群 七日热群
鼠肾  3 609411.1425160
猪肾  71510.14001
鸭肾  40410.25010
蛙肾  4 724120.25390
牛中段尿62610.16100
合计10 078560.5629261


2.6.3  宿主动物血清抗体监测
　　2001 2012年在3个监测点采集水鸭血清347份，阳性92份，阳性率为26.51%，采集青蛙血清249份，阳性14份，阳性率为5.62%，水鸭血清阳性率明显高于青蛙血清，差异有 统计学意义(χ2=43.278，P<0.05)；菌群包括黄疸出血群、秋季热群、流感伤寒群、爪哇群、波摩那群、赛罗群、七日热群共7种，优势菌株为黄疸出血群和秋季热群，共占78.30%(83/106)，见表5。

表5 2001-2012年衢州市钩体病监测点宿主动物血清抗体监测情况
Table 5 Serum antibody detection result in host animals in surveillance area in Quzhou, 2001-2012
标本类型 标本份数 阳性份数 阳性率/% 阳性标本的血清群
黄疸出血群 秋季热群 流感伤寒群 爪哇群 波摩那群 赛罗群 七日热群
水鸭血清3479226.51452952650
青蛙血清249145.628110022
合计59610617.79533062672


2.6.4 宿主动物聚合酶链反应(PCR)监测
　　2007年采集鼠、蛙肾进行PCR监测，共采集鼠、蛙肾87份进行PCR监测， PCR阳性16份，阳性率为18.39%，其中鼠肾57份，阳性16份，阳性率为28.07%，蛙肾30份，未检出阳性标本。
3 讨论
　　 根据2001 2012年疫情监测，衢州市钩体发病数逐年下降，2005年以来发病数更少，每年发病数仅有1～2例。其流行病学特征为: 季节性明显，农忙夏收季节(7 10月)是钩体病的高发期, 冬季几乎无病例报告；高发人群以青壮年农民为主，无死亡病例报告，与浙江省其他地区基本一致[3]。患者血清分型： 2001 2005年以七日热型为主，其次为黄疸出血型[4]；2006 2012年则以黄疸出血群为主, 与浙江省其他的研究结果基本一致[5]，人间流行菌群以七日热和黄疸出血群为主, 与历史报告未见明显变化[6]。
2001 2012年主要在鼠、蛙等宿主动物中共分离钩体菌株56株，宿主动物总带菌率为0.56%，其中鼠肾阳性率最高为1.14%，其次蛙肾阳性率为0.25%，提示衢州市钩体病传染源以鼠类为主，青蛙作为传染源也起了一定作用。菌群以黄疸出血群和秋季热群为优势菌群，分别占总菌群数的51.79%和46.43%，与浙江省其他地区以黄疸出血群为优势菌株不同 ，一般认为牛是七日热、赛罗群钩体病的重要传染源，而衢州市这两种菌株的检出率均较低，与凌锋等[5]的研究结果一致。
宿主动物鸭血清和蛙血清抗体阳性率较高，平均阳性率为17.79%，水鸭血清阳性率明显高于青蛙血清，提示在钩体病疫区水鸭感染率较高，水鸭养殖基地也起了传染源作用；血清群较多，但以黄疸出血群为优势群，秋季热群次之；蛙血清抗体血清型与蛙肾分离到的菌株血清群结果并不一致，蛙血清抗体血清型以黄疸出血型为主，而蛙肾阳性菌株则以秋季热群为主，其原因有待进一步调查。根据病例血清学检测结果，血清分型与宿主动物菌株分型也不完全一致。根据相关报道[7]，钩体PCR检出方法与常规培养法相比具有较高的灵敏性和特异性，宿主动物PCR钩体检出阳性率明显高于常规培养，因此，衢州市也把钩体PCR检测与传统钩体分离培养方法相结合，提高阳性检出率，为动物间钩体病的自然带菌率监测提供更为准确依据。同时，培养一支高水平的实验室队伍, 研究一种高敏感的方法对钩体的检出确有必要。
1996年以来衢州市未发生该型钩体病病例和暴发流行，与龙游县近年来未发生过洪涝灾害有一定的关系，该群在血清抗体检测占有一定的比重,一旦夏秋季节发生洪涝灾害，或钩体菌群出现更迭时，就有可能出现局部暴发疫情。衢州市是水灾多发地区, 又畜牧业为主, 因此洪灾引起暴发的危险始终存在。
衢州市钩体病发病少很大程度上与疫区群众作业方式和农作物种植季节和数量的改变有关，但可导致钩体病的局部暴发，浙江省其他地区有过报道[8]。因此,钩体病的防制工作仍不容乐观,应继续加强对宿主动物和人群的监测,注意菌群变动,防止钩体病的暴发[9]。
参考文献
[1] Fang CF, Yu ZY, Wang W, et al. Study on the surveillance of leptosp iro sis in Quzhou from 2001 to 2005 [J]. Chinese Journal of Vector Biology and Control,2008,19(2): 140- 143. (in Chinese)方春福,余樟友,王炜,等. 2001-2005 年衢州市钩端螺旋体病监测研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志,2008,19(2)：140-143.
[2] Health Ministry of Peop lepsRepublic oF China. GB 15995-1995Diagno sticcr iteria and prin ciples o f Lep to spirosis[S]. Beijing:Health Ministry of People's Republic of China, 1995. (in Chinese)中华人民共和国卫生部. GB 15995-1995钩端螺旋体病诊断标准及处理原则[S]. 北京: 中华人民共和国卫生部, 1995.
[3] Yang SX, Lin HJ. Surveillance of leptospirosis in Sanm en county, Zhejiang,2001-2007[J]. Disease Surveillance,2009,24(10):766-767,776.(in Chinese)杨盛旭,林海江. 200-2007年浙江省三门县钩端螺旋体病监测分析[J].疾病监测,2009,24(10)：766-767,776.
[4] Ying KM,Zhang MT.Surveillance of host animals of leptospirosis in Pan'an county, Zhejiang province,2007-2009[J]. Disease Surveillance,2011,26(1):40-41.(in Chinese)应凯满,张孟田. 2007-2009年浙江省磐安县钩端螺旋体病宿主动物监测分析[J]. 疾病监测,2011,26(1):40-41.
[5] Ling F,Wang Z,Jiang LP,et al.Leptospirosis surveillance in Zhejiang 1990-2005[J].China Preventive Medicine,2006,7(6):507- 509.( in Chinese)凌锋,王臻,姜理平,等.浙江省1990-2005年钩端螺旋体病监测研究[J].中国预防医学杂志,2006,7(6):507-509.
[6] Lyu YM,Yu ZY. Leptospirosis epidemiological surveillance analysis in Quzhou[J]. China Journal of Epidemiology,1995,16(3A):32.( in Chinese)吕跃民,余樟友. 衢州市钩端螺旋体病流行病学监测分析[J].中华流行病学杂志,1995,16(3A):32.
[7] Jiang LP, Meng Z, Cheng SY, et al. Development and application of a PCR method for detection of leptospira in Zhejiang province[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2007,17(8):1392-1394.(in Chinese)姜理平,孟真,程苏云,等. 浙江省钩端螺旋体PCR检测方法建立与应用[J].中国卫生检验杂志,2007,17(8)：1392-1394.
[8] Ying KM. Epidemiological survey of leptospira break out in Pan'an county[J]. Zhejiang Journal of Preventive Medicine,2008,20(12):31-32.(in Chinese)应凯满.一起钩端螺旋体病暴发的流行病学调查[J]. 浙江预防医学,2008,20(12)：31-32
[9] Chen ZB, Lei JB, Lan F. Surveillance of host animals of leptospirosis in Long'you county, Zhejiang province,2007-2011[J]. Disease Surveillance,2012,27(8):644-646.(in Chinese)陈忠兵,雷金宝,兰峰. 2007-2011 年浙江省龙游县钩端螺旋体病监测分析[J].疾病监测,2012,27(8):644-646.