窄食单胞菌属 (Stenotrophomonas) 是一个新命名的菌属，属于变形菌门、β-γ变形菌亚纲,严格非 发酵型专性需氧、具有运动能力的革兰阴性杆菌，以前称为嗜麦芽假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌。近几年除了嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)外，还鉴定了以下 11个种：好氧反硝化窄食单胞菌(S.nitritireducens)、微嗜酸窄食单胞菌(S.acidaminiphila)、嗜根窄食单胞菌(S.rhizophila)、 S.koreensis、S.terrae、S.humi、S.chelatiphaga、S.ginsengisoli、S.daejonensis、S.panachihumi和S.pavanii^[1]。嗜麦芽窄食单胞菌广泛分布于水、土壤、植物根系、农副产品、人和动物的体表与消化道^[2]。经常作为医疗设备和医院水源的污染菌引起医院内感染^[3]。虽然嗜麦芽窄食单胞菌致病性不强，但是它对免疫功能低下和住院患者构成巨大的威胁^[4],对呼吸道感染者能够造成不明机制的囊肿性纤维化(CF)^[5]，同时由于其携带多种耐药基因，对治疗造成困难^[4]。
多位点可变数目串联重复序列基因分型方法(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis，MLVA)在细菌种的水平和亚种水平上具有很好的鉴别能力，在许多病原菌的分型研究中都显示出良好的分型能力,目前国外已经建立了MLVA技术方法应用于嗜麦芽窄食单胞菌的研究报告^[6]。本研究对106株嗜麦芽窄食单胞菌菌株应用MLVA技术进行分子分型的研究，以探讨该方法在嗜麦芽窄食单胞菌分型中的可应用性，旨在将该方法推广应用于临床和研究领域。 1.1 菌株资料来源
　　106株嗜麦芽窄食单胞菌中有38株菌株引自文献[6], 68株为本实验室分离的菌株。菌株的鉴定方法包括VITEK Ⅱ 生化鉴定系统(BioMerieux, France)。
1.2 试剂与仪器
　　Taq DNA聚合酶，dNTP，100 bp DNA ladder Marker等PCR相关试剂购自TaKaRa公司, 仪器包括PCR扩增仪(Labcyclerk, SENAQUEST，德国), 凝胶成像仪( UVP，EC3 Darkroom,美国)。
1.3 方法
1.3.1  MLVA PCR扩增引物
　　MLVA PCR扩增引物序列参照文献[6],选择12个串联重复序列位点(variable-number tandem-repeat, VNTR),设计12对引物,引物序列见表1，引物由上海生物工程有限公司合成。
1.3.2 PCR扩增
　　25 μl PCR反应体系：10×Buffer(Mg²⁺，15 mmol/L) 2.5 μl，4种dNTP Mixture (均为2.5 mmol/L) 2.0 μl，10 ng DNA模板，1.0 U Taq DNA聚合酶，上、下游引物各0.8 μl(10 μmol/L)，用12对引物分别进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火温度参考表1，30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；最后72 ℃ 5min。
1.3.3 琼脂糖凝胶电泳
　　PCR产物3 μl经2％的琼脂糖凝胶，电压为6 V/cm电泳2 h，经Goldview染色，100 bp DNA ladder Marker进行分子质量标记。
1.3.4 MLVA重复单元拷贝数和聚类分析
　　使用UVP凝胶成像分析系统中的分子量计算软件对PCR产物的DNA片段碱基含量进行测算，选择每个VNTR位点有差别两个的PCR产物进行测序，进行序列比对，换算串联重复序列的拷贝数。以12个位点的串联重复序列拷贝数为变量，采用UPGMA方法，使用BioNumerics(Version 4.0, Applied Maths BVBA, Belium) 软件进行聚类分析。每个位点的分辨力采用HGDI指标(Hunter-Gaston discrimination index，HGDI)进行计算。 2.1 12个VNTR位点重复单元多态性
　　依据PCR扩增片段的大小,比较参考菌株K279a 基因组序列,测算出串联重复单元拷贝数,12个VNTR位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ串联重复单元拷贝数见表1,106株嗜麦芽窄食单胞菌12个VNTR位点等位基因型别数分别为8、2、6、6、5、10、5、4、5、7、5和6,不同的菌株各位点的重复单元拷贝数有差别,某些菌株基因组内不存在某一串联重复单元,在Ⅵ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ位点部分菌株表现为不完整的重复单元,如在Ⅵ位点,915菌株PCR扩增产物缺失了一个GTA GTG CCC GGC CGC TGG CCG GCA回文结构(SMAG结构)，在嗜麦芽窄食单胞菌中该结构核苷酸序列占整个基因组核苷酸总数的0.5％；在LMG959菌株，缺失了45 bp的碱基，一个G碱基取代了SMAG回文结构，在菌株1029, 66个碱基取代了回文结构(46 bp)和10 bp碱基的核苷酸序列，导致该位点增加了10个碱基。考虑到回文结构(SMAG)是嗜麦芽窄食单胞菌DNA特征结构， 与基因重组有关，故考虑作为特殊结构，参与VNTR的聚类分析中，分别以1a、1b和1c表示，1代表该位点上存在一个串联重复单元，由于碱基的增减，导致PCR产物长度发生了变化。在Ⅻ位点，3a和3b分别表示存在3个串联重复单元，由于在该位点内核苷酸的变化，PCR扩增产物长度发生了改变。聚类分析图“XJ-sheep(44)”和“XJ-cattle(24)”中44和24表示12个位点具有相同基因型的菌株数，在Ⅺ和Ⅻ位点菌株XJ-sheep(44)和XJ-cattle(24)存在着3.5和2.5拷贝的串联重复单元，这些特殊变化，均作为变量参与聚类分析。图1为串联重复序列位点Ⅳ部分菌株凝胶电泳图谱。
2.2  68株嗜麦芽窄食单胞菌MLVA分析
　　以HGDI指标计算每个位点的分辨力，其中最强的为VNTR位点Ⅵ，依次为Ⅰ、Ⅹ、Ⅻ、Ⅺ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅶ、Ⅱ，106株 br>
表1 MLVA 12对引物序列(5′～3′)
Table 1 Primer sequences and loci of MLVA for S. maltophilia strains

VNTR 位点	上游引物 下游引物	退火温度 (℃)	重复单元 长度(bp)	重复单元 拷贝数	HGDI指标及95%可信区间
Ⅰ	CAC CGC CGA GTG CGA TGC CGA TCT T ACC CGA CCG TGG ACA TGG ACG TGC G	69	50	0,1,2,3,4,5,7,10	0.847(0.801~0.893)
Ⅱ	GAC GTG AAG TGG CTG CGC CTG AAG C CGT TCC AGC CAC TGT ACC GCC ACC A	65	29	1,2	0.358(0.215~0.500)
Ⅲ	GTG GTG GTG ATC AAG CGC GGC AAG G GGC AGG TCG GCT GGA TGG CGG TAC T	68	79	0,1,2,3,5,6	0.779(0.736~0.823)
Ⅳ	CAG GAA CGA TGT GCG GGC AGT GAC C CTG TCC GAA ACA CAT GGC GTG GCA G	66	32	0,1,2,3,4,5	0.756(0.690~0.823)
Ⅴ	TGA TCG GCA TCA TCG TGG TCG GTA C GCG AGT ACC TGA GCG AAC TGG GGT G	65	161	0,1,3,4,5	0.755(0.679~0.831)
Ⅵ	CAG CAT CAT CAA CAA GCA CCA TGG C TATC GCT TCC TGA CCA AAC CGT GGA	65	106	0,1,2,3,4,5,6,7,8,9	0.917(0.875~0.958)
Ⅶ	GCC GCT GGT CTG GCC GTT GAT GAT G GCT GGA GCT GCA CCT GAG CGC CTG G	65	37	0,1,2,3,4	0.624(0.508~0.741)
Ⅷ	TGG ACC GCC ACC GAC TAC CTG ATG G CAC CAC CAC CAC CGA GGT CTA CCC G	67	197	0,1,3,4	0.727(0.674~0.780)
Ⅸ	CGA GTA CTT CAC CCC GGT CAA CGA G AGG GCC AGA CCT TCG AGG AAT TCA A	65	172	0,1,2,4,5	0.746(0.662~0.830)
Ⅹ	TGG TGG TCA ATG ATG GGC AGC CGG A CCG CCA CGA TGA CTG GTC TCA GCC G	66	67	0,1,3,4,5,15,17	0.833(0.770~0.897)
Ⅺ	CAC AGG TCA CAC AGC GTG GTG TAC G GGT TGT TCG GCA TCG GTT TGA TCA T	65	141	0,1,2,3,4	0.815(0.754~0.876)
Ⅻ	CGC CAT CCA GCC GTC CTG TAC TGC T GGC GGG TTG GGT GGG TAC TAC CTG G	66	103	0,1,2,3,4,5	0.824(0.763~0.886)

  注：(1)MLVA-PCR扩增片段在K279a菌株基因组上的位置，退火温度可根据PCR扩增仪的不同作调整，此退火温度只供参考。

图1 8株嗜麦芽窄食单胞菌串联重复序列位点IV PCR 产物的凝胶电泳图谱
Figure 1 Agarose electrophoresis result of PCR amplification products of VNTR IV in 8 S. maltophilia isolates    注： M 为100 bp DNA 分子质量标准；泳道1～8为8株嗜麦芽窄食单胞菌PCR扩增电泳图谱。

嗜麦芽窄食单胞菌根据12个位点的串联重复单元拷贝数,以12个位点的拷贝数100％ 相似性为判断标准,聚类分析可将106株嗜麦芽窄食单胞菌分为34个基因型；以12个位点的拷贝数45％相似性为判断标准,可将106株嗜麦芽窄食单胞菌分为11个群(C1~C11),具有流行病学关系的C1群中的OBGTC9、OBGTC10和OBGTC20菌株；C4群中916、1019和1053菌株；C5群中528和571菌株意大利分离的菌株主要在C1、C6、C7和C9群内；尼泊尔分离的菌株主要在C1、C3、C4、C5、C8和C11群内；而日本分离的菌株主要在C10群内；C7群中来自我们的68株嗜麦芽窄食单胞菌XJ-sheep(44)和XJ-cattle(24)具有相同的基因型(图2)。
2.3 稳定性试验
　　为了验证12个位点的稳定性，对分离的菌株 XJ-sheep(44)和XJ-cattle(24)中各选择2株菌株，连续传代培养10次，每代菌株分别提取菌株基因组DNA，对12个位点进行PCR扩增，12个位点的重复单元拷贝数没有改变。 　　嗜麦芽窄食单胞菌分型方法包括表型分型和基因分型，表型分型方法包括生物分型、血清分型、毒力试验、脂脂肪酸分型和蛋白质分析。基因分型方法主要有核糖体分型，质粒分型，16S rRNA分型，23S rRNA分型，gyrB 序列分型，限制性扩增片段长度多态性(AFLP)，DNA-DNA杂交，脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)， 随机引物扩增片段长度多态性分析(RAPD)， 基因间保守重复序列分型(ERIC-PCR) 和多位点序列分析(MLST)^[7]。这些分型方法各有优缺点，总的说来，不是操作繁琐，就是不能数字化，MLST

图2 106株嗜麦芽窄食单胞菌MLVA聚类分析图
Figure 2 Cluster analysis of MLVA types of 106 S. maltophilia strains
虽然可以数字化，实验室内和实验室间资料具有可比性的优点，但是需要测序，提交网站，获得ST型。MLVA分子分型技术,目前日趋成熟，其优点是：操作简单，并能提供数字式的分型信息，具有很高的鉴别力和可重复性，在某种程度上与表型有对应关系。在鉴别菌株的地理来源,菌株的回溯分析和暴发事件中，具有很好的流行病学上的相关性。
本研究发现MLVA分型方法适于嗜麦芽窄食单胞菌分子流行病学研究。通过对12个VNTR位点分析，发现在某一时间，某一地区分离的菌株具有相同的基因型。分离自我国某一地区牧场牛血液中的68株菌株，具有同一基因型，说明该技术方法具有较好的分辨力和流行病学上的应用价值。意大利、尼泊尔和日本分离的菌株尽管具有不同的基因型，但可以聚集在同一群内。通过对12个VNTR位点进行2～12个位点不同的组合聚类分析发现，以12个VNTR位点聚类分析具有较好的流行病学意义。
在聚类分析上，本文应用聚类分析软件BioNumerics进行分析，该分析软件选取一定的拷贝数相似性系数，聚类结果可以分析菌株间的关联，相似性系数越大，其菌株间的流行病学关联程度越高，比较文献[6]，进一步提高了其流行病学上的分析意义。本方法需要更多的菌株资料，进一步丰富菌株的分型结果和菌株的比较，可以更好的解释其流行病学意义。

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