疾病监测, 2013, 28(10): 797-801
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.10.004
Human coronaviruses infection in patients with acute respiratory tract infection in Beijing, 2011-2012
SHI Wei-Xian1, MA Hong-mei2, YU Xia-li1, CUI Shu-juan1, HUANG Fang1
Beijing Municipal Center For Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China
Abstract
Objective To understand the infection status of human coronaviruses (HCoVs) in patients with acute respiratory tract infection and epidemiological characteristics of HCoVs infection in Beijing. Methods From 2011 to 2012, throat swabs or sputum samples were collected from the patients with acute respiratory tract infection in 5 sentinel hospitals in Beijing, the patients' basic information were collected too. All the samples were tested with RT-PCR using specific primers to detect HCoV. The positive amplicons were sequenced to identify the virus type. The Results were analyzed with SPSS 17.0. Results Twenty samples were HCoV positive in 1619 samples (1.24%), including 9 from the patients with upper respiratory tract infection (1.11%) and 11 from the patients with lower respiratory tract infections (1.36%). Among 20 positive samples, 13 were OC43, 6 were 229E, 1 was NL63. The positive rate was higher in 2011 (1.82%,14/769)than in 2012(0.71%,6/850), the difference was statistically significant (χ2=4.112,P=0.043), but the differences in monthly positive rates had no statistical significance. The age specific positive rate in age group 25-59 years was highest (1.96%, 13/663), followed by age group 0-4 years (1.92%, 3/208) and other age groups (<1%). The differences in age specific positive rates were statistically significant. The positive rates of OC43 in age groups 25-59 and 0-4 years were high, the difference had statistical significance (χ2=5.007, P=0.026). The difference in gender specific positive rate of HCoVs had no statistical significance. The differences in clinical symptoms caused by different types of HCoVs were not statistically significant. Conclusion During 2011-2012, HCoV-229E and HCoV-OC43 were the predominant HCoVs in Beijing. The circulating type and related intensity varied with year but had no obvious seasonality. Infants/young children and adults are the risk populations of HCoVs infection, especially HCoV-OC43 infection. The differences in clinical symptoms caused by different types of HCoVs are not statistically significant.
Keywords:    acute respiratory infection   coronavirus   epidemiology  

2011-2012年北京地区急性呼吸道感染患者冠状病毒感染状况分析
石伟先1, 马红梅2, 于霞丽1, 崔淑娟1, 黄芳1
1. 北京市疾病预防控制中心, 北京 100013;
2. 北京市顺义区疾病预防控制中心
摘要
目的 了解北京地区急性呼吸道感染患者中冠状病毒感染状况,探讨其流行特征。 方法 2011-2012年,每月自北京地区5家哨点医院采集10~15份急性呼吸道感染病例咽拭子、痰液标本,并收集患者相关信息,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测冠状病毒,通过对阳性扩增产物核苷酸序列分析确定其型别,应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。 结果 共检测急性呼吸道感染病例样本1619份,检出冠状病毒阳性样本20份,总阳性率为1.24%,其中9份为急性上呼吸道感染,11份为急性下呼吸道感染,检出阳性率分别为1.11%和1.36%;OC43型阳性13份,229E型阳性6份,NL63型1份。2011年阳性检出率(1.82%,14/769)高于2012年(0.71%,6/850),差异有统计学意义(χ2=4.112,P=0.043);不同月份检出阳性率差异无统计学意义; 229E型冠状病毒在2011年与2012年的检出率差异有统计学意义(χ2=4.711,P=0.03)。25~59岁年龄组检出阳性率最高,为1.96%;其次为0~4岁组,检出阳性率为1.92%,其余年龄组均低于1%,各年龄组的阳性率差异有统计学意义。OC43型在0~4岁婴幼儿组与25~59岁成人组中有较高的检出阳性率,差异有统计学意义(χ2=5.007,P=0.026)。不同性别患者中冠状病毒检出阳性率差异无统计学意义。不同型别冠状病毒感染导致的急性上呼吸道感染与急性下呼吸道感染及临床症状表现上差异无统计学意义。 结论 2011-2012年北京地区冠状病毒感染主要是OC43和229E两种型别;不同年份冠状病毒流行强度及流行型别有一定差异,但其流行季节特征不明显;婴幼儿及成年人是冠状病毒感染的主要人群,并以OC43型为主。不同型别冠状病毒导致的临床症状无明显差异。
关键词:    急性呼吸道感染   冠状病毒   流行病学  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 标本采集
1.2 冠状病毒核酸检测
1.3 其他呼吸道病毒核酸检测
1.4 pol基因序列测定
1.5 统计学分析
2 结果
2.1 冠状病毒总检出情况
2.2 不同时间冠状病毒检出情况
2.3 不同年龄组患者中冠状病毒检出情况
2.4 不同性别患者中冠状病毒检出情况
2.5 冠状病毒感染患者的临床特征
3 讨论
　　冠状病毒是引起人类急性呼吸道感染的常见病原体之一，通常只引起普通感冒，但在婴幼儿、老年人和免疫抑制患者中可引起严重的下呼吸道感染。感染人类的冠状病毒常见的血清型为OC43型及229E型。继2003年出现SARS冠状病毒后，2004年和2005年又相继发现了NL63和HKU1两种新型冠状病毒[1]。2012年9月在中东地区重症肺炎病例中再次发现新型冠状病毒， 世界卫生组织(WHO)在2013年5月将其正式命名为“中东呼吸综合征冠状病毒”(MERS-CoV， Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus)[2]。人冠状病毒再次成为人们研究的热点。为了解冠状病毒在北京地区的感染状况，评估不同型别冠状病毒对首都北京这个国际化大都市的危害程度，笔者对2011 2012年北京地区急性呼吸道感染患者进行冠状病毒检测及临床特征分析，以了解北京地区冠状病毒的感染状况，为冠状病毒有效防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 标本采集
　　收集2011年1月至2012年12月于北京市第六医院、垂杨柳医院、东方医院、顺义区医院和潞河医院5家哨点医院就诊的急性呼吸道感染患者1619例(男883例，女736例)，其中急性上呼吸道感染包括流感样病例、扁桃体炎等共809例，急性下呼吸道感染包括肺炎、支气管炎等共810例。采集患者发病3天内咽拭子或深咳痰液，4 ℃24 h内运送至实验室，-80 ℃保存。同时收集患者临床资料和流行病学资料。
1.2 冠状病毒核酸检测
　　采用德国QIAGEN公司生产的QIAamp viral RNA mini Kit试剂盒，按照试剂盒说明书提取病毒RNA。采用Invitrogen公司SuperScriptⅢ One-Step RT-PCR System with PlatinumTaq DNA Polymerase试剂盒，利用文献[3]中可同时有效检出当前人群中常见的OC43、229E、NL63、HKU1型冠状病毒通用引物HCoV-F:5′-GGT TGG GAC TAT CCT AAG TGT GA-3′，HCoV-R：5′-CCA TCA TCA GAT AGA ATC ATC ATA-3′，检测冠状病毒RNA聚合酶pol基因上440 bp长的目的片段。反应体系为：2×Reaction Mix 12.5 μl，SuperScriptⅢ/ PlatinumTaq Mix 1 μl，引物各1 μl(10 μmol/L)，模板RNA 5 μl，加去离子水至25 μl。反应条件为50 ℃ 50 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，扩增35个循环；68 ℃延伸5 min。
MERS-CoV核酸检测采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应 (real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction， rRT-PCR)，利用Invitrogen公司产SuperScript ⅢOneStep RT-PCR System试剂盒进行荧光定量PCR扩增。引物为ORF1b-F:5′-TTC GAT GTT GAG GGT GCT CAT-3′，ORF1b-R:5′-TCA CAC CAG TTG AAA ATC CTA ATT G-3′，探针为ORF1b-P:FAM-CCC GTA ATG CAT GTG GCA CCA ATG T-TAMRA，检测ORF1b基因，反应体系为：2×Reaction Mix 12.5 μl， SSIII/Taq EnzymeMix 1 μl，引物各1 μl(10 μmol/L)， 探针0.5 μl(10 μmol/L)，BSA 1 μl(1 mg/ml)，MgSO4(50 mmol/L) 0.4 μl，模板RNA 5 μl，加去离子水至25 μl。反应条件为：55 ℃ 20 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s；58 ℃ 30 s并收集荧光信号；反应45个循环；40 ℃ 30 min，详见文献[4]。
1.3 其他呼吸道病毒核酸检测
　　分别使用PCR、RT-PCR、多重RT-PCR等检测腺病毒、偏肺病毒、副流感病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肠道病毒、博卡病毒及等其他呼吸道病毒，引物序列及反应条件见文献[5]。
1.4 pol基因序列测定
　　将冠状病毒PCR阳性扩增产物送上海生工公司进行序列测定，测序结果在GenBank中进行Blast比对分析，获得冠状病毒分型结果。
1.5 统计学分析
　　采用统计软件SPSS 17.0对检测样本在不同时间、不同年龄组、不同性别人群中的检测情况及临床表现进行统计分析。率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 冠状病毒总检出情况
　　1619份样本使用RT-PCR共检出20份冠状病毒核酸阳性样本，总阳性率1.24%；其中9份为急性上呼吸道感染病例样本，检出阳性率为1.11%(9/810)，11份为急性下呼吸道感染病例样本，检出阳性率为1.36%(11/809)，经χ2检验，二者差异无统计学意义(χ2=0.205，P=0.651)。MERS-Cov未见检出。
冠状病毒PCR阳性扩增产物经测序分析，结果显示其中13份为OC43型，其检测阳性率为0.80%；6份为229E型，其检测阳性率为0.37%；1份为NL63型，其检测阳性率 为0.06%。经检测其他呼吸道病毒，结果表明1份样本为OC43型与Ⅰ型副流感病毒混合感染。经χ2检验，不同型别冠状病毒检测阳性率差异有统计学意义(χ2=10.945，P=0.004)。
2.2 不同时间冠状病毒检出情况
　　分别对2011年与2012年不同月份的冠状病毒检测情况进行统计，结果显示2011年总阳性检出率为1.82%(14/769)，2012年总阳性检出率则为0.71%(6/850)，经χ2检验，2011年与2012年冠状病毒检测阳性率差异有统计学意义(χ2=4.112，P=0.043)。
对不同月份冠状病毒检测情况进行分析，结果未见明显季节特征。两年中1 3月及9 12月的秋冬季总阳性检出率为1.29%(14/1089)，4 8月的春夏季总阳性检出率为1.13%(6/530)，经χ2检验，二者差异无统计学意义(χ2=0.069，P=0.793)。2011年自9月起检出阳性率开始上升，至10月达最高，为5.36%(3/56)，随后呈下降趋势，至2012年1月检测阳性率下降为0。而2012年中，仅于3、6、7、12月中有检出，其中6月检出阳性率最高，为5.77%(3/52)。
OC43型在2011年和2012年的检测阳性率分别为0.91%(7/769)和0.71%(6/850)，经χ2检验，二者差异无统计学意义(χ2=0.212，P=0.645)。其月份分布未见明显特征，其中2011年6月检出阳性率最高，达5.77%；4、5和8月未检出；229E型在2011年阳性率达0.78%(6/769)，2012年未见检出(0/850)，经χ2检验，其检出阳性率差异有统计学意义(χ2=4.711，P=0.03)；2011年中检出月份以3月和5月的春季及10 12月的秋冬季为主，夏季未检出。NL63仅在2011年11月检出1例，见图1。

图1 2011-2012年北京地区不同时间冠状病毒检出情况
Figure 1 Number of HCoVs positive respiratory samples and detection rate in Beijing, 2011-2012
2011-2012年北京地区不同时间冠状病毒检出情况

2.3 不同年龄组患者中冠状病毒检出情况
　　对不同年龄组病例的冠状病毒检测结果统计分析，结果显示，25～59岁年龄组检出阳性率最高，为1.96%；其次为0～4岁组，检出阳性率为1.92%；15～24岁组，检出阳性率为0.85%；60岁以上年龄组，阳性率为0.29%；5～14岁组未检出。经χ2检验，0～4岁组与25～59岁组较高检出阳性率差异有统计学意义(χ2=7.931，P=0.005)，表明0～4岁婴幼儿与25～59岁成年人是冠状病毒感染的主要人群。对不同年龄组感染冠状病毒型别进行统计，结果显示在0～4岁婴幼儿组中229E、OC43、NL63型均有检出，15～24岁组中仅检出OC43型，25～59岁组中检出229E及OC43型，而60岁以上年龄组中则仅检出229E。经χ2检验，OC43型在0～4岁婴幼儿组与25～59岁成年人组中有较高的检出阳性率，差异有统计学意义(χ2=5.007，P=0.026)，见表1。

表1 2011-2012年北京地区不同年龄组冠状病毒检出情况
Table 1 Detection results of HCoVs in different age groups in Beijing, 2011-2012
年龄组(岁) 检测数 229E OC43 NL63 总计 构成比/%
阳性数 阳性率/% 阳性数 阳性率/% 阳性数 阳性率/% 阳性数 阳性率/%
0～20810.4820.9610.4841.9220.00
5～16600.0000.0000.0000.000.00
15～23600.0020.8500.0020.8510.00
25～66340.6091.3600.00131.9665.00
60～34610.2900.0000.0010.295.00
合计161960.37130.8010.06201.23100.00


2.4 不同性别患者中冠状病毒检出情况
　　所检测的1619份样本中，男性患者中冠状病毒检出阳性率为1.25%(11/883)，女性患者中检出阳性率为1.22%(9/736)，经χ2检验，二者差异无统计学意义(χ2=0.002，P=0.967)。11例冠状病毒男性感染者中，8例为OC43型感染，2例为229E型感染，1例为NL63型感染；9例女性感染者中，5例为OC43型感染，4例为229E型感染。
2.5 冠状病毒感染患者的临床特征
　　收集患者体温、呼吸道症状、血象等临床表现信息，结果见表2。
9例上呼吸道感染者中OC43型感染者有7例，229E型感染者为2例；11例下呼吸道感染者中OC43型感染者有6例，229E型感染者为4例，NL63型感染者为1例，经χ2检验，不同型别冠状病毒导致患者上呼吸道感染或下呼吸道感染差异无统计学意义(χ2=13.943，P=0.379)。
对不同型别冠状病毒引起的临床表现进行分析，结果显示OC43型阳性病例患者出现咳嗽、发热、肺部渗出症状检出率高于229E阳性病例，而229E型阳性病例患者出现咳痰、头痛、肌肉痛症状检出率高于OC43型(表2)。

表2 冠状病毒感染病例临床症状
Table 2 Clinical characteristics of patients with human coronavirus infections
HCoV型别 咳嗽 发热(≥38 ℃) 咽喉痛 咳痰 头痛
例数 构成比/% 例数 构成比/% 例数 构成比/% 例数 构成比/% 例数 构成比/%
229E44/633/644/644/622/6
OC431212/131111/1366/1344/1333/13
NL6311/1000011/100
合计17141095
HCoV型别 胸痛 肺部罗音 肺部渗出/实变 肌肉痛 白细胞计数升高
例数 构成比/% 例数 构成比/% 例数 构成比/% 例数 构成比/% 例数 构成比/%
229E22/611/60011/611/6
OC4322/1322/1333/1311/1311/13
NL630011/111/10000
合计44422


3 讨论
　　 本研究通过扩增冠状病毒RNA聚合酶pol基因上的保守片段检测急性呼吸道感染患者咽拭子中各型别冠状病毒，并对其阳性扩增产物测序分析后确定具体型别，操作简便、快速，结果可靠，但该通用引物对MERS-CoV检测有效性如何，尚无报道。将本研究使用引物序列与公布的MERS-CoV(GenBank号：JX869059)[4]序列比对，结果显示正向引物中5′端起第9与第12位的2个碱基不匹配，反向引物中5′端起第3个碱基有不匹配，由于PCR反应中引物5′端序列对PCR影响不大[6]，应可检出MERS-CoV。为防止漏检，本研究同时使用特异引物进行了MERS-CoV检测，结果未见检出。因此本研究中使用的检测冠状病毒保守片段的引物对MERS-CoV检测有效性尚需进一步实际应用效果评估。
冠状病毒在人群中的感染率随研究对象、样本采集种类、采集时间、研究地域不同而有较大差异，其检出阳性率0.1%~8.2%不等 ，本研究选取分布于北京地区城区、郊区的5家哨点医院，在监测期间均衡采样，力求保证结果可靠。结果显示2011 2012年中北京地区急性呼吸道感染病例中冠状病毒的检出阳性率为1.24%，其型别构成比为OC43型占65%，229E型占30%，NL63占5%，表明OC43型、229E型为北京地区冠状病毒感染的主要型别，与相关报道一致[3]。本研究中仅检出1例NL63型，未检出HKU1型，表明这两种新型冠状病毒在北京地区2011 2012年度中感染率较低。
有研究认为冠状病毒多发于冬季及早春，在人群中流行强度、流行型别呈周期性[11]，本研究结果显示北京地区2011年冠状病毒阳性率明显高于2012年，其中229E型仅在2011年中有检出，表明北京地区冠状病毒的流行呈年度周期性，与报道相同。不同型别冠状病毒未见明显季节特征，四季均有检出，这可能与北京地区夏季高温天气持续时间较短等地理气候有关。
本研究结果显示，人群中冠状病毒感染率及感染型别与患者性别无关，与相关报道一致[11]。当前儿童中冠状病毒感染状况研究较多[7]，而对于其他年龄组中的感染状况研究较少，本研究采集了各年龄组患者样本，结果显示25～59岁成年人及0～4岁婴幼儿中冠状病毒检出阳性率均明显高于其他年龄组，表明北京地区除婴幼儿外，成年人也是冠状病毒的主要感染人群。
有研究认为不同型别冠状病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，其中多数OC43、229E型感染者症状较轻，免疫低下人群感染OC43型易导致严重肺炎 。NL63、HKU1型感染婴幼儿除易导致严重肺炎外，易引起严重并发症[4]。本研究结果表明，229E与OC43型冠状病毒导致的患者临床症状表现上无明显差异，且其导致的急性上呼吸道感染与急性下呼吸道感染阳性率相当，提示冠状病毒感染也易导致肺炎等严重下呼吸道感染，有关部门应给予足够重视。

参考文献
[1] Chen YH. Research Progress in Novel Human CoronavirusNL63 and Human C oronavirusHKU1 [J].Medical Recapitulate, 2010,16(17):2596-2598.(in Chinese)陈云欢.两种新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1的研究进展[J].医学综述,2010,16(17):2596-2598.
[2] Zheng Y, Yang P. The study on the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus[J]. International Journal of Virology, 2013,20(3)97-99.(in Chinese)郑阳,杨鹏. 中东呼吸综合征冠状病毒研究现况[J].国际病毒学杂志,2013,20(3)97-99.
[3] Ren L, Gonzalez R, Xu J, et al. Prevalence of human coronaviruses in adults with acute respiratory tract infections in Beijing, China[J]. J Med Virol, 2011,83(2):291-297.
[4] Corman VM, Eckerle I, Bleicker T, et al. Detection of a novel human coronavirus by real-time reverse-transcription polymerase chain reaction [J]. Euro Surveill, 2012,17(39):20285.
[5] Ren L,Gonzalez R, Wang ZW, et al. Prevalence of human respiratory viruses in adults with acute respiratory tract infections in Beijing,2005-2007 [J]. Clin Microbiol Infect, 2009,15(12):1146-1153.
[6] Liang GD. The latest experimental techniques in molecular biology[M]. Beijing： Science Press,2001. (in Chinese)梁国栋,主编.最新分子生物学实验技术[M].北京：科学出版社,2001.
[7] Gaunt ER, Hardie A, Claas ECJ, et al. Templeton epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method [J]. J Clin Microbiol,2010,48(8):2940-2947.
[8] Lau SK, Woo PC, Yip CC, et al. Coronavirus HKU1 and other coronavirus infections in Hong Kong [J]. J Clin Microb,2006,44(6):2063-2071.
[9] Qin YF, Xu K, Qi X, et al. Epidemic characteristics of coronavirus infection in Nanjing from 2010 to 2012 [J]. International Journal of Virology, 2013,20(2):55-60.(in Chinese)秦圆方,许可,祁贤,等. 2010 2012年南京市呼吸道冠状病毒流行病学特征分析[J].国际病毒学杂志,2013,20(2):55-60.
[10] Hu Q, Tan WJ. The research developing of human coronavirus OC43 [J]. Chinese Journal of Preventive Medcine, 2013,43(7):661-663.(in Chinese)胡琴,谭文杰. 人冠状病毒HCoV-OC43的研究进展 [J].中华预防医学杂志,2013,43(7):661-663.
[11] Huang F, Shi WX, Cui SJ, et al.Epidemiological analysis on virus etiology of acute respiratory infection during Oct 2010 and Apr 2011 in Beijing[J]. International Journal of Virology, 2011,18(4):97-100.(in Chinese)黄芳,石伟先,崔淑娟,等.北京地区2010年10月至2011年4月急性呼吸道感染病毒流行特征分析[J].国际病毒学杂志,2011,18(4):97-100.
[12] Shi WX, Peng XM, Han LL, et al. Virus etiology in children with acute upper respiratory infect ion in Beijing [J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2008,18(7):1263-1265.(in Chinese)石伟先,彭晓旻,韩莉莉,等.北京地区儿童急性上呼吸道感染病毒病原学调查[J].中国卫生检验杂志,2008,18(7):1263-1265.