疾病监测, 2013, 28(10): 857-860
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.10.018
Drug resistance and genotype of β-lactamases-producing Klebsiella pneumoniae in ICU patients with nosocomial infection
LIU Li-xin1, ZHANG Hua-ping2
Taozhu Central Hospital, Linhai, Linhai 317013, Zhejiang, China
Abstract
Objective To explore the genotype and the drug resistance characteristics of ESBLs and AmpC-lactamase producing Klebsiella pneumoniae in ICU patients with nosocomial infection and provide evidence for the clinical medication. Methods The isolates were identified with VITEK 60 System; the ESBLs detection and drug sensitivity test (Kirby-Bauer method) were conducted according to the standards recommend by CLSI; the suspected AmpC-lactamase producing strains were screened with cefoxitin disk diffusion test. the genotypes were analyzed with cefoxitin three-dimensional test and PCR sequencing. Results Of the 97 isolates, 31.96% were ESBLs positive, 13.40% were AmpC-lactamase positive. Among them, only AmpC-lactamase producing isolates accounted for 7.22%; both AmpC-lactamase and ESBLs producing isolated accounted for 6.19%; only ESBLs producing isolates accounted for 25.77%. The drug resistant genes of all 13 AmpC-lactamase positive strains belonged to genotype DHA-1. ESBLs producing strains were resistant to more drugs than the non ESBLs producing strains. Both AmpC-lactamase and ESBLs producing isolates had more serious drug resistance. Conclusion The detection rates of AmpC-lactamase and ESBLs producing Klebsiella pneumoniae were high in ICU patients. All the AmpC-lactamase belonged to genotype DHA-1 and both AmpC-lactamase and ESBLs producing Klebsiella pneumoniae strains were multi-drug resistant.
Keywords:    intensive care unit   nosocomial infection   Klebsiella pneumoniae   AmpC-lactamase   genotype   ESBLs   drug resistance  

重症监护病房患者医院感染产β-内酰胺酶和头孢菌素酶的肺炎克雷伯菌耐药性及基因型研究
刘立新1, 章华萍2
1. 临海市桃渚中心卫生院, 浙江 临海 317013;
2. 台州市中心医院
摘要
目的 探讨重症监护病房(ICU)患者医院感染产β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)的肺炎克雷伯菌耐药基因型及对常用抗菌药物的耐药特性,为临床合理用药提供参考依据。 方法 细菌鉴定采用VITEK-60型全自动微生物鉴定仪鉴定;ESBLs和药敏试验K-B纸片法按CLSI推荐的方法;产AmpC酶菌株筛选采用头孢西丁纸片扩散法;产AmpC酶菌株确证试验采用三维试验;通过酶粗提物头孢西丁三维试验、PCR测序等实验分析该菌株的基因型。 结果 97株肺炎克雷伯菌ESBLs和AmpC酶总检出率分别为31.96%和13.40%,其中,单产AmpC酶、同产AmpC酶+ESBLs及单产ESBLs菌株检出率分别为7.22%、6.19%和25.77%;13株产AmpC酶阳性菌株的耐药基因型均为DHA-1;产酶菌株对抗菌药物耐药率明显高于非产酶株。同产AmpC酶+ESBLs菌株耐药现象更为严重。 结论 ICU患者肺炎克雷伯菌产AmpC酶和ESBLs菌株检出率较高,AmpC酶基因型均为DHA-1型,产AmpC酶和ESBLs菌株对多种抗菌药物呈耐药状态。
关键词:    重症监护病房   医院感染   肺炎克雷伯菌   AmpC酶   ESBLs   基因型   耐药性  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
1.1.2 试剂
1.2 方法
1.2.1 医院感染诊断标准
1.2.2 ESBLs确证试验
1.2.3 产AmpC酶菌株筛选
1.2.4 产AmpC酶确证试验
1.2.5 基因检测
1.2.6 DNA测序
1.2.7 药敏试验
2 结果
2.1 ESBLs阳性菌株检出率
2.2 产AmpC酶菌株初筛结果
2.3 产AmpC酶菌株确证结果
2.4 产AmpC酶菌株多重PCR基因检测结果
2.5 PCR产物测序结果
2.6 药敏试验结果
3 讨论
　　肺炎克雷伯菌是重症监护病房(ICU)患者感染中较为常见的革兰阴性杆菌，随着广谱抗生素的广泛应用，其耐药性问题日趋严重，其中主要的耐药机制是由质粒介导的β-内酰胺酶，如超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶(亦称头孢菌素酶)，有时两种酶同时存在，导致对多种抗生素耐药，已引起国内外临床医师的高度关注。为了解ICU患者肺炎克雷伯菌ESBLs和AmpC酶的产生、耐药性及耐药基因表型情况，现对台州市中心医院ICU近两年从各类标本所分离的97株肺炎克雷伯菌进行产ESBLs和AmpC酶的检测及药敏试验，并对产AmpC酶菌株进行三维试验、PCR检测耐药基因，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
　　97株肺炎克雷伯菌分离自2010年7月至2012年6月台州市中心医院ICU患者痰液、血液、尿液、分泌物等标本。菌株系分离自每位独立患者的标本，并已排除同一患者的重复相同菌株。全部菌株均经常规生化方法及VITEK-60型全自动细菌鉴定仪鉴定确认。质控菌株：阴沟肠杆菌029M作产AmpC酶阳性对照，肺炎克雷伯菌ATCC700603作AmpC酶阴性对照，并作ESBLs阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作ESBLs和AmpC酶阴性对照。
1.1.2 试剂
　　所有药敏纸片均为英国Oxoid公司产品。MH肉汤、MH琼脂、血培养基、麦康凯等培养基均为杭州天和微生物试剂公司产品。
1.2 方法
1.2.1 医院感染诊断标准
　　按2001年中华人民共和国卫生部审定的医院感染诊断标准[1]。患者均为入院72 h后发病，有感染的临床表现或在原有感染的基础上出现新的感染，血、尿、痰、中心静脉导管尖及局部引流物病原学培养证实有感染者。
1.2.2 ESBLs确证试验
　　按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2010年推荐的ESBLs确证试验标准[2]进行。用头孢他啶(30 μg/片)与头孢他啶/克拉维酸(CD02. 30 μg/10 μg/片)和头孢噻肟(30 μg/片)与头孢噻肟/克拉维酸(CD03. 30 μg/10 μg/片)对两组中任何一种药物，抑菌圈直径相比增大值≥5 mm时，判定为产ESBLs。用肺炎克雷伯菌ATCC700603菌株作质控。
1.2.3 产AmpC酶菌株筛选
　　根据2010年CLSI推荐的K-B纸片标准[2]。采用待测菌株用头孢西丁(30 μg/片)扩散法筛选耐药菌株，以抑菌圈≤18 mm作为疑产AmpC酶菌株。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、作阴性对照，阴沟肠杆菌029M作阳性对照。
1.2.4 产AmpC酶确证试验
　　采用三维试验[3]。酶粗提物制备：将AmpC酶表型筛选呈阳性的肺炎克雷伯菌转种到麦康凯平板上，经35 ℃孵育18～24 h，然后挑取受试菌制成0.5麦氏单位菌液。取50 μl菌液，加入10 ml胰大豆蛋白胨肉汤中，35 ℃恒温摇床200 r/min振荡培养6 h，4000 r/min 4 ℃离心20 min，弃上清液，收集细菌于2 ml离心管，-80 ℃反复冻融5次，再用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液1.5 ml悬浮，旋涡混匀，1400 r/min 4 ℃离心1 h，取上清液(含酶粗提取物)，无菌试验后-20 ℃保存待用。三维试验：将质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922(3.0×108 cfu /ml)菌液均匀涂布于MH琼脂平板，将30 μg头孢西丁纸片置于平板中心，用无菌刀片在离纸片边缘5 mm处由里向外切割一道沟槽，将25 μl酶粗提物由里向外加入沟槽内，将MH平板置于35 ℃孵育16 ~18 h，观察抑菌圈的形状。头孢西丁纸片的抑菌圈有缺失者为阳性，无变化者为阴性。以阴沟肠杆菌029M的酶粗提物作阳性对照。
1.2.5 基因检测
　　对确证产AmpC菌株采用美国Thermo HYbaid公司生产的HRSPO520 PCR扩增。以阴沟肠杆菌029M菌株作为产AmpC酶阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照进行多重PCR。引物设计参照Perez-Perez和Hanson[4]的方法，由上海生工生物技术有限公司合成。结合我国地区所报道的AmpC酶基因型情况 ，选择5对引物，5对引物及相应扩增片段的长度见表1。PCR体系(50 μl)：10×缓冲液5 μl，dNTPs混合液(2.5 mmol/L)4 μl，引物(25 μmol/L)1 μl，模板各1 μl，Taq DNA聚合酶0.5 μl。反应条件：93 ℃预变性2 min，94 ℃变性60 s，55 ℃退火60 s(OprD2 57 ℃)，72 ℃延伸60 s，重复35个循环，最后一个72 ℃延长至5 min。取PCR产物5 μl在1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色紫外灯下成像，观察分析结果。

表1 AmpC酶基因PCR引物序列
Table 1 Primer sequence in PCR for AmpC-lactamase gene
基因名称引物序列(5′→3′)产物长度
/bp
FOXP1ACC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G190
P2CAA AGC GTA ACC GGA TTG G
MIR/ACT-1P1TCG GTA AAG CCG ATG TTG CGG303
P2CTT CCA CTG CGG CTG CCA GTT
ACCP1ACC AGC CTC AGC AGC CGG TTA346
P2TTC GCC GCA ATC ATC CCT AGC
DHA-1、DHA-2P1AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T405
P2CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC
CITP1TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA462
P2TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC


1.2.6 DNA测序
　　将聚合酶链反应(PCR)扩增后产物交上海生工生物技术有限公司进行纯化、测序。测序使用双脱氧末端终止法，在ABI PRISMTM377自动测序仪上进行。测序结果经DNAstar软件接拼，与GenBank中的BLAST程序进行比对分析，确定其基因型。
1.2.7 药敏试验
　　参照2010年CLSI推荐的标准[2]，采用K-B纸片扩散法，并以大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。
2 结果
2.1 ESBLs阳性菌株检出率
　　97株肺炎克雷伯菌经ESBLs酶确证试验共检出产ESBLs菌株共31株，阳性率为31.96%。
2.2 产AmpC酶菌株初筛结果
　　97株肺炎克雷伯菌经头孢西丁敏感试验对头孢西丁耐药的有17株，占17.53%。
2.3 产AmpC酶菌株确证结果
　　对筛选疑产AmpC酶阳性的菌株再经三维试验确证有13株阳性，产AmpC酶为13.40%。其中在检出31株产ESBLs菌株中，有6株经三维试验确证同时产AmpC酶(6.19%)；25株均未检出产AmpC酶，为单产ESBLs菌株(25.77%)；7株为单产AmpC酶菌株(7.22%)。
2.4  产AmpC酶菌株多重PCR基因检测结果
　　 13株经三维试验确证产AmpC酶的菌株中，经多重PCR 13株均扩增出405 bp的特异性条带，为DHA基因阳性。DHA质粒AmpC酶的检出率为13.40%。
2.5 PCR产物测序结果
　　13株PCR阳性的菌株再经一步采用相应特异性引物进行全长基因扩增，结果与引物DNA均扩增出405 bp阳性条带。通过GenBank中对应序列比较，与美国GenBank基因库中的AmpC酶基因序列比对相同，属DHA-1型。
2.6 药敏试验结果
　　97株产β-内酰胺酶与非产酶株对20种常用抗菌药物的体外耐药率结果见表2。

表2 97株肺炎克雷伯菌产酶株与非产酶株对常用抗菌药物的耐药率
Table 2 Resistance to common antibiotics of 97 strains of β-lactamases-producing and non β-lactamases-producing Klebsiella pneumoniae
抗菌
药物		 单产AmpC
酶菌株
(n=7) 		单产ESBLs
菌株
(n=25) 		产AmpC酶
+ESBLs菌株
(n=6)		 非产AmpC
和ESBLs
菌株(n=59)		抗菌
药物		 单产AmpC
酶菌株
(n=7) 		单产ESBLs
菌株
(n=25) 		产AmpC酶
+ESBLs菌株
(n=6)		 非产AmpC
和ESBLs
菌株(n=59)
美洛培南0.00.00.00.0头孢呋辛71.461.683.38.5
亚胺培南0.00.016.70.0头孢唑啉71.460.083.313.6
头孢吡肟14.312.016.7 8.5头孢曲松 85.768.083.37.9
阿米卡星28.624.038.3 11.9头孢他啶 85.772.0100.020.0
左氧氟沙星 28.620.033.313.6头孢噻肟 71.464.083.35.1
环丙沙星 42.944.050.010.2哌拉西林85.772.083.310.2
哌拉西林/他唑巴坦42.924.050.0 5.1氨苄西林85.772.0100.0 10.2
氨苄西林/舒巴坦57.452.066.711.9替卡西林/克拉维酸 57.444.083.38.5
头孢他啶/克拉维酸57.444.066.723.7阿莫西林/克拉维酸71.460.083.3 15.3
庆大霉素42.940.083.3 15.3氨曲南85.780.0100.0 18.6

3 讨论
　　肺炎克雷伯菌是医院感染重要的条件致病菌之一。近年来，随着β-内酰胺类抗生素，尤其是头孢菌素在临床的广泛应用，肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药性呈明显上升趋势，成为当今全球临床感染治疗面临的棘手问题。ICU患者基础疾病严重、免疫力低下，加上机械通气、气管插管等各种侵入性操作频繁，成为医院感染最常见亦最为严重的科室。克雷伯菌属是天然缺乏AmpC酶基因的菌株，但可以通过质粒引入AmpC基因而持续高表达AmpC酶，因此，从肺炎克雷伯菌中检测到的AmpC酶绝大多由质粒携带的AmpC基因编码，并可通过转化、接合等方式在细菌间传递，造成传播和流行[5]。本研究采用AmpC酶可以水解头孢西丁，根据这一特点对ICU患者分离的肺炎克雷伯菌进行产AmpC酶菌株初筛，在此基础上进一步采用三维试验来确证产AmpC酶菌株。结果13株三维试验阳性，占13.4%，高于邱清芳[9]等报道的6.5%，与本地区林平[8]等报道的检出率15.56%基本相似，但明显低于陈燕等[10]报道的29.3%。分析其原因除了可能与所检测的菌株多重耐药有关外，还可能与地域等因素有关。本研究资料中还对这13株确证产AmpC酶菌株应用多重PCR技术简化质粒DNA基因检测，采用5对引物进行PCR扩增检测基因型，结果13株肺炎克雷伯菌均扩增出约405 bp的条带，扩增产物经过双向测序以及和GenBank数据库比对，发现和DHA-1型酶基因序列100% 同源。显示我地区AmpC酶基因型流行主要为DHA-1型。同时，本研究结果发现所分离的肺炎克雷伯菌以单产ESBLs为主，同产ESBLs和AmpC酶占6.19%。
目前CLSI仍未出台关于产AmpC酶检测的标准，但所推荐的利用头孢西丁敏感试验的方法虽操作简单，但往往存在有一定的假阳性。本研究中，从耐头孢西丁的17株肺炎克雷伯菌中，经三维试验有4株阴性，说明对头孢西丁不敏感的原因不一定是AmpC酶所致，有可能与菌细胞对药物的通透性降低有关[11]，也有可能这种现象已转入了AmpR基因呈诱导型表达，也有可能是由于所产生的AmpC酶量活力低，而三维试验灵敏度不够有关，有待进一步研究。
药敏试验结果可以看出，非产酶株对20种常用抗菌药物均显示较好的敏感性，产酶株对碳青霉烯类抗菌药物美洛培南、亚胺培南具有很高的敏感性，对第四代头孢菌素、左氧氟沙星和阿米卡星亦具有较高的敏感性。本研究结果还表明，从酶抑制复合剂对单产AmpC酶和单产ESBLs菌株来看，前者耐药率高于后者，说明酶抑制剂可以抑制ESBLs，但对AmpC酶抑制不十分明显，而且他唑巴坦和舒巴坦对AmpC酶和ESBLs呈现不同的抑制作用，他唑巴坦的抗菌活性明显强于舒巴坦。因此临床实验室应加强对产β-内酰胺酶菌株的常规检测，及时掌握耐药动态，指导临床合理使用抗菌药物，控制耐药菌株的蔓延。

参考文献
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