疾病监测, 2014, 29(1): 28-31
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2014.01.008
The first detection of Norovirus GⅡ.4 Sydney variant in Guangxi, 2012
CHEN Min-mei, ZHOU Kai-jiao, JU Yu, TANG Yi
Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Prevention and control, Nanning 530028, Guangxi, China
Abstract
Objective To understand the genotypes of circulating Norovirus strains in Guangxi in 2012. Methods A total of 323 fecal samples collected from diarrheal children under 5 years old in 2012 were detected for Norovirus with RT-PCR, and corresponding sequences of partial VP1 region were analyzed and phylogenetic tree was constructed. Results Among the samples detected, twenty-four were Norovirus positive. Based on partial sequences of VP1 region, two strains belonged to genotype Ⅰ, twenty-two belonged to genotype Ⅱ. Three of 22 GⅡ strains collected in November and December belonged to GⅡ.4 Sydney 2012 cluster,eighteen strains belonged to the 2006b cluster and one belonged to the GⅡ.6 cluster. Conclusion The circulating Norovirus genotypes were with diversity, and Norovirus GⅡ.4 Sydney variant was first detected in Guangxi.
Keywords:    norovirus   genotype   GⅡ.4 Sydney variant  

2012年广西首次检出诺如病毒GⅡ.4 Sydney变异株
陈敏玫, 周开姣, 居昱, 谭毅
广西壮族自治区疾病预防控制中心, 广西 南宁 530028
收稿日期：2013-10-30
作者简介：陈敏玫，女，广西陆川县人，硕士，主要从事病毒性传染病防控工作
通讯作者：陈敏玫，Tel：0771-2518763，Email：damichen@sina.com
摘要
目的 了解2012年广西壮族自治区（广西）罗城县诺如病毒流行株基因型谱分布。方法 2012年收集323例5岁以下腹泻患儿粪便标本，反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测诺如病毒，对VP1区部分核苷酸序列进行测定并构建核苷酸系统进化树。结果 检测323例病例粪便标本，诺如病毒阳性24份（7.43%）；诺如病毒GⅠ基因组2份（8.33%），GⅠ.4和GⅠ.6各1份；GⅡ基因组22份（91.67%），GⅡ.6基因型1份（1/22），GⅡ.4基因型21份（21/22）。GⅡ.4中，18份（85.71%）属于2006b变异株簇，3份（14.29%）属于Sydney变异株簇。结论 2012年广西罗城县诺如病毒流行株基因型呈现多样性，以GⅡ.42006b变异株为优势流行株，首次检出GⅡ.4 Sydney变异株。
关键词:    诺如病毒   基因型   GⅡ.4 Sydney变异株  
内容大纲
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.2 标本处理
1.3 RNA提取和诺如病毒反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)鉴定
1.4 核酸序列测定和分析
2 结果
2.1 检测结果
2.2 基因分型和序列分析
2.3 时间分布
3 讨论

诺如病毒(Norovirus，NoVs)是引起急性胃肠炎的主要病原之一，超过90%的非细菌性腹泻以及全球约有50%的腹泻与诺如病原相关[1] [2]。诺如病毒属于杯状病毒科，单链小RNA病毒，可分为5个基因组(G I～G V)， G I和GⅡ基因组与人群中大部分急性胃肠炎相关[3]。根据诺如病毒VP1基因S区，将G I和GⅡ基因组分别分为14和17个基因型，其中GⅡ.4变异快，GⅡ.4基因型每2～3年出现新的变异株，导致约60%～80%的急性胃肠炎疫情暴发流行[4]。2012年底，多个国家和地区报道发现GⅡ.4 Sydney变异株，导致当地胃肠炎疫情暴发[5][6][7]。GⅡ.4 Sydney变异株在广西壮族自治区(广西)是否流行，尚未报道。为了解广西诺如病毒基因型谱以及GⅡ.4 Sydney变异株的流行情况，2012年在广西罗城县监测点开展诺如病毒监测，结果报告如下。

1 材料与方法
1.1 研究对象  

2012年1-12月在罗城县对5岁以下急性腹泻住院婴幼儿进行监测并收集粪便标本，标本收集对象要求每日排便3次或3次以上，且大便形状有改变(呈稀便、水样便)，大便常规镜检WBC<15，未见RBC的腹泻病例，或病例表现为腹泻未达到3次/日，但伴有大便性状改变和呕吐症状，或以呕吐为主要症状。收集病例粪便标本，采集后置-20 ℃冻存。

1．2 标本处理  

取约0.1 g固体粪便或0.1 ml液体粪便标本至1.5 ml Epppendorf 管中，加入0.9 ml 粪便稀释液，制备10%粪便悬液，剧烈振荡后8000 r/min离心5 min，吸取上清备用。

1．3  RNA提取和诺如病毒反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)鉴定  

以磁珠法提取病毒RNA，50 μl EB洗脱。RNA提取试剂盒购置AB公司。提取的RNA以六碱基随机引物(TaKaRa，0.2 μg/μl)进行反转录，待检标本RNA 11 μl，随机引物(0.2 μg/μl)1 μl，混匀，短暂离心，95 ℃变性5 min，立即冰浴；短暂离心后在反应管中加入其他反应物，合成病毒cDNA文库，反应条件参考试剂盒说明书(Invitrogen公司)。使用PCR方法扩增诺如病毒VP1区部分核苷酸，引物参考文献[8]，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成(HPLC级)，DNA聚合酶购自Promega公司。

1．4 核酸序列测定和分析  

PCR产物387 bp，送北京博迈德公司进行序列测定。用于序列进化分析的参考株来自NCBI的GenBank，使用clustalX1.8 和Mega 4.0 进行序列比对和同源性分析， 并用邻近归并法(Neighbor-joining， NJ)构建核苷酸系统进化树。

2 结果
2.1 检测结果  

2012年罗城县共收集5岁以下腹泻患儿粪便标本323份，检出诺如病毒核酸阳性标本24份，阳性检出率为7.43%。

2.2 基因分型和序列分析  

序列测定获得24份诺如病毒VP1区部分核苷酸序列，通过诺如病毒自动分型软件分析(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/)[9]，属于4种不同基因型，其中诺如病毒GⅠ基因组2份(8.33%)，GⅠ.4和 GⅠ.6各1份；诺如病毒GⅡ基因组22份(91.67%)，GⅡ.4基因型21份(95.45%)，GⅡ.6基因型1份(4.55%)。在GⅡ.4基因型中，21份核苷酸序列一致性为95.7%～100.0%，在系统进化树中分为2簇(图1)，18份(85.71%)与GⅡ.4 2006b变异株在进化树的同一簇，与参考株AB291542核苷酸一致性为98.3%～98.9%，另3份(14.29%)与GⅡ.4 Sydney变异株(JX459908)的同源性为98.9%～100.0%，在同一分支上。没有检测到GⅡ.4 New Orleans 变异株。

图1 诺如病毒VP1区部分核苷酸序列系统进化树
Figure 1 Phylogenetic analyses of partial VP1 region of detected norovirus genomes

2.3 时间分布  

2012年1 8月收集的病例标本中检出诺如病毒2份(2/105)，9 11月收集的标本诺如病毒检出率升高，其中10月检出率最高，为18.64%(11/59)；11月和12月在3例病例标本中检测到GⅡ.4 Sydney变异株，见表1。

表1 2012年广西罗城县诺如病毒基因分型时间分布
Table 1 Monthly distribution of samples with different genotypes detected，2012
月份 病例数 诺如病毒基因型
检测 诺如病毒阳性 GⅠ GⅡ4.Sydney cluster GⅡ4.2006b cluster GⅡ.6
1-810520011
92931020
10591100110
119360240
123721100
合计3232423181
3 讨论

诺如病毒是一组具有高度遗传多样性的单链RNA病毒，在人群中流行的基因组主要有GⅠ基因组的14种基因亚型和GⅡ基因组的17种基因亚型，其中GⅡ.4基因型因具有与流感病毒相似的高效传播和快速变异的特点，自1995年以来，至少出现4次新旧变异株的更替(1995年的US95/96株、2002年的Farmingtong Hills株、2004年Hunter株、2006年2006 a/b变异株)而导致全球急性胃肠炎疫情流行[10]。2012年底，在澳大利亚、美国等先后报道诺如病毒急性胃肠炎疫情暴发，并在病例标本中发现新的GⅡ.4 Sydney变异株[5][6][7]。近几年，诺如病毒GⅡ.4 2006b变异株一直是我国散发和暴发急性胃肠炎的病原流行优势株[11][12]，但在2012年底至2013年初，我国北京、香港、广州、江苏省等地区均报告GⅡ.4 Sydney变异株的流行[13][14][15][16]，国内其他地区是否出现该变异株，尚未有相应报道。广西罗城县腹泻监测点建立于2006年，当地诺如病毒的流行特点与其他地方相似，以2006b变异株为主要流行株[17]。在2012年度的监测中，检测到GⅠ.4、GⅠ.6、GⅡ.4和GⅠ.6共4种基因型，与2007 2008年度罗城县单一GⅡ.4流行基因型比较，罗城县诺如病毒流行基因型呈现多样性，但仍以GⅡ.4 为主要流行基因型，2006b变异株为主要流行株，同时在11月和12月的3例散发病例中检测出GⅡ.4 Sydney变异株，这是在广西首次发现诺如病毒 GⅡ.4 Sydney变异株。2012年诺如病毒检出率为7.43%，尤其是11月和12月诺如病毒检出率，与2007 2011年同期相比，没有明显升高(数据未列出)，提示广西罗城县虽然在散发病例中发现新的GⅡ.4 Sydney变异株，但尚未出现诺如病毒急性胃肠炎暴发流行。由于本监测仅在罗城县开展监测以及监测病例有限，GⅡ.4 Sydney变异株在广西境内的流行特点仍需进一步研究。鉴于GⅡ.4 Sydney变异株在丹麦等地首先在散发病例中发现，后引起疫情暴发的流行特征[18]，需警惕广西地区诺如病毒GⅡ.4 Sydney变异株代替2006b变异株，引起急性胃肠炎的暴发流行。



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