疾病监测, 2014, 29(1): 32-36
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2014.01.009
Changes of PD-1/PD-L1 in peripheral blood in AIDS patients receiving highly active antiretroviral treatment for 24 weeks
YANG Yue-ming, XU Wen-fang, WU Yong
The 6th People's Hosptital of Shaoxing, Shaoxing 312000, Zhejiang, China
Abstract
Objective To discuss the changes in expression of programmed death-1(PD-1) and programmed cell death 1 ligand l(PD-L1) in AIDS patients receiving highly active antiretroviral treatment(HAART) for 24 weeks. Methods According to the CD4+T cell counts, 45 AIDS patients receiving HAART were divided into three groups(1-100 cells/μl, 101-200 cells/μl and 201-350 cells/μl ), Peripheral blood samples were taken before HAART and at 24 weeks after HAART, PD-1/PD-L1 expressions on CD4+ T cells were assessed by flow cytometry, Plasma HIV RNA loads were determined by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(PCR). The data were analyzed with t test and Pearson correlation analysis. Results The PD-1 and PD-L1 expression levels on CD4+T cells in AIDS patients were(1.16±0.26)% and(0.63±0.140)% respectively before HAART, which were significantly higher those of healthy controls(t=6.31 and 4.27, all P<0.01). The PD-1 and PD-L1 expressions levels were(0.76±0.14)% and(0.52±0.06)% 24 wwks later. The PD-l expression level declined significantly compared with that before HAART(t=3.77,P=0.000). The PD-L1 expression level declined too compared with that before HAART, but no statistically significance was found(t=1.78,P=0.056).The PD-1 expression level in patients with CD4+T cell count of 201-350 showed a remarkable decline than two other groups(38.54% vs. 25.66% and 23.77%) 24 weeks later, The decline rate of PD-L1 expression levels was greater than those of two groups(18.97% vs. 15.87% and 12.31%). The level of PD-1 expression was significantly negatively correlated with CD4+T cell count before HAART and 24 weeks later (r=-0.434 and-0.317;P<0.01 or 0.05), and was significantly positively correlated with viral load before HAART and 24 weeks later(r=0.499 and 0.319, P<0.01 or 0.05). The PD-L1 expression level was significantly negatively correlated with the CD4+T cell count before HAART and 24 weeks later(r=-0.454 and-0.314, P=0.002 and 0.012), and was significantly positively correlated with viral load before HAART and 24 weeks later(r=0.513 and 0.428, all P=0.000 and 0.004). Conclusion The expression levels of PD/PD-L1 were up-regulated in AIDS patients and associated with HIV disease progress
Keywords:    programmed death-l   disease progress   acquired immunodeficiency syndrome   highly active antiretroviral treatment  

高效抗反转录病毒疗法治疗24周艾滋病感染者外周血中PD-1/PD-L1的变化特点
杨越明, 许文芳, 吴勇
绍兴市第六人民医院, 浙江 绍兴 312000
收稿日期：2013-10-9
基金项目：浙江省绍兴市重点科技计划项目（No.2011A23016）
作者简介：杨越明，女，浙江省绍兴市人，副主任护士，主要从事医院感染工作
通讯作者：杨越明，Tel：0575-88055649，Email：1060896216qq@126.com
摘要
目的 探讨高效抗反转录病毒疗法（highly active antiretroviral treatment，HAART）治疗24周AIDS患者外周血程序性死亡因子（programmed death-1，PD-1）和配体（Programmed cell death 1 ligand l，PD-L1）表达水平的特点变化。方法 选取HAART治疗的45例艾滋病感染者（AIDS），按CD4+T细胞计数分成1~100 cells/μl、101~200 cells/μl和201~350 cells/μl三组，于抗病毒前和抗病毒24周时采集静脉血，同时选取21名健康体检者作对照。运用流式细胞仪检测外周血中CD4+T细胞表面PD-1和PD-L1的表达水平，实时荧光定量PCR仪检测血浆病毒载量，数据处理采用t检验，相关性分析采用Pearson相关。结果 AIDS感染者治疗前PD-1/PD-L1的表达频率为（1.16±0.26）%和（0.63±0.140）%，均显著高于健康对照组（t分别为6.31和4.27，P=0.000 ）。抗病毒治疗24周时PD-1/PD-L1在CD4+T细胞中的表达频率分别为（0.76±0.14）%和（0.52±0.06）%，与治疗前相比PD-1表达水平显著下降（t=3.77，P=0.000），PD-L1的表达频率也有所下降，但差异无统计学意义（t=1.78，P=0.056）。CD4+T细胞基数为201~350 cells/μl患者组其PD-1表达频率在治疗24周后平均下调率明显高于另二组（38.54% vs. 25.66%和23.77%），而PD-L1的表达也高于1~100 cells/μl和101~200 cells/μl二组（18.97% vs 15.87%和12.31%）。治疗前与治疗后AIDS感染者CD4+T细胞数与PD-1表达百分率呈显著负相关（r=-0.434，-0.317，P=0.009和0.031），与病毒载量呈显著正相关（r分别为0.499和0.319，P为0.0049和0.032）。PD-L1表达频率在治疗前与治疗后与CD4+T细胞数呈显著负相关（r=-0.454和-0.314，P=0.002和0.012），与病毒载量在治疗前后呈显著正相关（r=0.513和0.428，P=0.000和0.004）。结论 AIDS感染者外周血PD-1/PD-L1的表达水平增加，且与疾病进展密切相关。
关键词:    程序性死亡因子-1   疾病进展   获得性免疫缺陷综合征   高效抗反转录病毒疗法  
内容大纲
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.2 抗病毒治疗和随访
1.3 检测方法
1.3.1 标本采集、仪器与试剂
1.3.2 CD+4T淋巴细胞绝对计数
1.3.3 PD-1/PD-L1检测
1.3.4 病毒载量检测
1.4 统计学分析
2 结果
2.1 AIDS患者抗病毒前后外周血PD-1、PD-L1的表达水平
2.2 不同CD+4T细胞基数患者外周PD-1、PD-L1的表达水平
2.3 治疗前后PD-1、PD-L1细胞的表达水平与CD+4T细胞数目、HIV RNA的相关性分析
3 讨论

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV；艾滋病病毒)特异性T细胞在控制HIV病毒感染和病毒复制中起着重要作用，它可通过细胞毒性作用直接杀伤病毒感染的细胞，并可分泌一些细胞因子，阻断病毒进入靶细胞[1]，但由于其细胞在HIV感染者体内存在许多的功能缺陷，从而严重影响了HIV特异性T细胞的活性。程序性死亡因子-1及其配体是近年来研究发现的最具代表的负性共刺激信号通路之一，其高表达与T细胞免疫缺陷密切相关，是导致T淋巴细胞功能耗竭的重要机制之一[2][3]。目前高效抗反转录病毒疗法(highly active antiretroviral treatment， HAART)是国内外公认获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome， AIDS，艾滋病)的有效治疗手段，最大限度地，降低血浆病毒载量，促进患者体内免疫功能的恢复和重建。国内外研究显示程序性死亡因子(programmed death-1，PD-1)和配体(programmed cell death 1 ligand l，PD-L1)信号通路影响机体的抗HIV免疫应答，但其在抗病毒免疫中所起的生物学效应尚不清楚。本研究通过观察45例AIDS患者HAAPRT治疗不同时期外周血中外周血PD-1/PD-L1表达水平的变化，初步研究HAART治疗过程中PD-1/PD-L1负性抑制途径的表达特点。

1 材料与方法
1.1 研究对象  

45例AIDS患者来源于2010 2012年绍兴市第六人民医院或绍兴市疾病预防控制中心(CDC)就诊者，其中男性31例，女性14 例;年龄为18~64岁，平均为(39.17±10.64)岁。所有感染者均经浙江省或绍兴市CDC免疫印迹试验确证HIV-1抗体阳性，并在入组前均未进行过抗病毒治疗，入选的 所有感染者均在全面了解本研究方案的基础上签署知情同意书。研究方案经本院医学伦理委员会批准。21例正常对照组均为该院健康体检者，其中男性14例，女性7例，年龄20～55岁，平均(36.47±12.32)岁，二组间性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 抗病毒治疗和随访  

入组患者均给予HARRT治疗：齐多夫定(AZT)300 mg+拉米夫定(3TC)300 mg(qd)+奈韦拉平(NVP)200 mg(bid)/依非韦仑(EFV)600 mg(qd)，并跟踪随访24周。

1.3 检测方法  
1.3.1 标本采集、仪器与试剂 

流式细胞仪购置美国Beckman Coulter公司，型号为EPICS XL4-MCL型，试剂为CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)/CD8-藻红蛋白标记(PE)/CD3-藻红蛋白花青苷(Percp)三色荧光抗体、CD4－FITC、溶血剂等购自美国Becton Dicknson公司，PE标志的B7-H1、PD-1及同型对照管购自美国eBioscience公司；病毒载量检测仪器为美国Roche 公司的Light Cycler 480实时荧光PCR仪，试剂购于深圳匹基生物工程公司；血常规检测仪为Beckman GEN.S五分类血液分析仪。抽取HAART治疗前及治疗24周时患者及健康对照者的标本，用EDTA抗凝负压真空采血管采集外周静脉血，在6 h内进行试验。

1.3.2 CD+4T淋巴细胞绝对计数 

取10 μl CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Percp单克隆抗体加入流式上样试管中，然后加入50 μl全血，振荡混匀，室温避光10 min，溶血，于室温放置10 min后上流式细胞仪检测得CD+4T细胞的百分率，其得到的百分率通过外周淋巴细胞数计算绝对值。

1.3.3 PD-1/PD-L1检测 

取3支专用流式试管，分别加入抗人CD4-FITC抗体10 μl和Mouse IgG 1-PE同型质控2.5 μl、抗人CD4-FITC抗体10 μl和抗PD-1-PE抗体2.5 μl、抗CD4-FITC抗体10 μl和抗人B7-H1-PE抗体2.5 μl，然后每管各加入全血50 μl，混匀，避光15 min后加入1 ml溶血剂，室温放置10 min，1500 r/min离心，5 min弃上清，再分别加入1 ml生理盐水，混匀，1500 r/min离心5 min后弃上清液，最后加入500 μl生理盐水重悬细胞，上流式细胞仪检测。采用FS-SS参数分析基础上对全血外周单个核细胞(PBMC)设门，设定CD4阳性细胞门，检测CD+4T细胞上B7-H1/PD-1的表达水平，并扣除同型对照的非特异性本底值。

1.3.4 病毒载量检测 

用美国Roche 公司的Light Cycler 480实时荧光PCR仪定量检测感染者血浆中HIV-1 RNA含量，试剂为深圳匹基生物工程公司，严格按照操作说明进行。

1.4 统计学分析  

所有资料采用SPSS 17.0软件分析，结果以均值±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。使用Spearman rank进行相关性分析。统计概率采用双侧检验，P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 AIDS患者抗病毒前后外周血PD-1、PD-L1的表达水平  

AIDS患者治疗前CD+4T细胞数显著低于健康对照组(t=8.19，P=0.000)，PD-1和PD-L1表达频率显著高于健康组(t分别为6.31和4.27，P=0.000)。AIDS患者抗病毒治疗24周时与治疗前相比，CD+4T细胞数、PD-1表达水平和病毒载量差异均有统计学意义(t=3.54、3.77和4.15，P=0.001，0.000和0.000)；PD-L1表达水平治疗低于治疗前，但差异无统计学意义(t=1.78，P=0.056)，结果见表1。

表1 AIDS患者治疗前后外周血CD+4T数、PD-1、 PD-L1的表达水平和病毒载量
Table 1 CD+4 cells， PD-1， PD-L1 and viral load levels in AIDS patients before HAART and 24 weeks later
%
组别CD+4(cell/μl)PD-1/%PD-L1/%HIV RNA/log(copies/ml)
健康对照组857±2720.47±0.140.19±0.09/
治疗前182±761.16±0.260.63±0.145.37±0.43
治疗24周352±1070.76±0.140.52±0.063.18±0.38
2.2 不同CD+4T细胞基数患者外周PD-1、PD-L1的表达水平  

根据AIDS患者治疗前外周血CD+4T细胞数目，将受试者分为三组，第一组患者：1 cells/μl+4T细胞数≤100 cells/μl，第二组患 者：100 cells/μl+4T细胞数≤200 cells/μl，第三组患者： 200 cells/μl+4T细胞数≤350 cells/μl，比较不同CD+4T细胞基数水平的两组患者外周血PD-1、PD-L1细胞的表达水平。

从表2可见， PD-1/PD-L1表达水平在治疗前后均随着CD+4T细胞数目的增加而下降。治疗前后200 cells/μl+4T细胞数≤350 cells/μl 患者组PD-1细胞表达水平最低，分别为(0.96±0.19)%和(0.59±0.13)%， 1 cells/μl+4T细胞数≤100 cells/μl的PD-1的表达频率最高，分别为(1.22±0.26)%和 (0.93±0.21)%，治疗前1~100 cells/μl 组患者与201~350 cells/μl 组患者PD-1表达水平差异有统计学意义(t=2.49，P=0.027)。CD+4T细胞数为201~350 cells/μl 患者组其PD-1细胞表达水平与治疗前相比，表达下调了38.54%，而101~200 cells/μl 和 1~100 cells/μl 患者组则下降了25.66%和23.77%。PD-L1表达水平在治疗前三组比较差异无统计学意义(F=1.27，P=0.059)，但治疗后三组相比差异有统计学意义(F=2.38，P=0.034)。与治疗前相比，治疗后201~350 cells/μl 患者组PD-L1细胞表达水平下调了18.97%，101~200 cells/μl 和1~100 cells/μl 患者组则分别下降了15.87%和12.31%，结果见表2。

表2 AIDS患者不同CD+4T细胞基数水平 PD-1/PD-L1表达频率
Table 2 PD-1/PD-L1 expression in AIDS patients with different CD+4 counts
%
CD+4(cell/μl) 例数 PD-1 PD-L1
治疗前 24周治疗 治疗前 24周治疗
 1~100121.22±0.260.93±0.210.65±0.190.58±0.16
101~200141.13±0.220.84±0.160.63±0.170.53±0.15
201~350190.96±0.190.59±0.130.58±0.130.47±0.15
2.3 治疗前后PD-1、PD-L1细胞的表达水平与CD+4T细胞数目、HIV RNA的相关性分析  

治疗前与治疗后CD+4T细胞数与PD-1表达百分率呈显著负相关(r=-0.434，-0.317，P=0.009和0.031)，与病毒载量呈显著正相关(r分别为0.499和0.319，P分别为0.0049和0.032)。PD-L1表达频率在治疗前与治疗后与CD+4T细胞数呈显著负相关 (r=-0.454和-0.314，P=0.002和0.012)，与病毒载量在治疗前后呈显著正相关(r=0.513和0.428，P=0.000和0.004)。结果见图1～4。

图1 治疗前后CD+4细胞数与PD-1表达水平的相关性
Figure 1 Correlation between PD-1 expression level and CD+4T lymphocyte count before and after HAART
图2 治疗前后病毒载量与PD-1表达水平的相关性
Figure 2 Correlation between PD-1 expression level and HIV RNA viral load before and after HAART
注:(1)“▽”为治疗前；(2)“○”为治疗后;(3)“ ”治疗前；(4)“-”治疗后。
图3 治疗前后CD+4细胞数与PD-L1表达水平的相关性
Figure 3 Correlation between PD-L1 expression level and CD+4T lymphocyte counts before and after HAART
图4 治疗前后病毒载量与PD-L1表达水平的相关性
Figure 4 Correlation between PD-L1expression level and HIV RNA viral load before and after HAART
3 讨论

程序性死亡因子-1和程序性死亡因子配体l是近来发现的CD28分子家族的新成员，常在活化的淋巴细胞呈现高水平表达，研究发现T淋巴细胞PD-1高表达与其细胞免疫缺陷关系密切，是导致病毒持续感染及肿瘤免疫逃逸的重要机制之一[4-6]。T淋巴细胞上的PD-1与PD-L1可以通过细胞之间的接触互相结合，抑制T细胞的增生和I型细胞因子的产生[7]，从而降低了机体特异性T细胞的免疫功能，诱导产生免疫耐受，导致病毒的持续感染。本研究通过流式细胞仪的检测发现AIDS患者在治疗前CD+4T细胞上的PD-1/PD-L1表达频率显著高于健康对照组，HIV病毒核酸富含尿嘧啶的RNA序列可作为toll样受体的识别配体，被单核及树突细胞TLR7/8识别，启动了依赖于髓样分化蛋白88(MyD88)的TLR信号，诱导B7-H1表达[8]，HIV-1 Nef蛋白p38蛋白激酶(MAPK)途径诱导B7-H1配体PD-1表达[9]，这可能是AIDS患者外周血PD-1/PD-L1高表达的重要因素，与此同时，我们发现抗病毒治疗后PD-1的表达频率比治疗前显著下调，治疗24周时AIDS患者外周血PD-L1的表达比治疗前也有降低，但差异无统计学意义，与Rosignoli等[10]研究结果有所不同，这种差异有可能与入组的人数、种族、抗病毒治疗的时机、剂量、疗程等有关。

曹清华等[11]等较早的研究发现HIV-1感染者外周血中调节性T细胞表面PD-1表达与疾病进展相关。而洪坤学等[12]进一步证实HIV感染者CD+8T细胞表面PD-1在CD+4T细胞计数<200细胞/μl的HIV感染者中的表达水平显著高于细胞数>500细胞/μl的感染者，本研究结果也发现CD+4T细胞基数高的患者在治疗前其PD-1/PD-L1的表达水平均比基数低的患者要低，同时CD+4T细胞基数较高的患者，在经24周治疗后其外周血CD+4T细胞上PD-1和PD-L1的下调百分率要高于CD+4T细胞基数低的患者，此结果说明在抗病毒治疗过程中CD+4T细胞基数高的患者机体较基数低的患者具有较高的特异性T淋巴细胞免疫效应，使体内特异性细胞免疫功能的恢复较快。PD-L1表达水平在抗病毒24周时与治疗前相比其下调不显著，此结果考虑可能与观察例数少或周期较短有关，尽管如此，我们发现无论是PD-1还是PD-L1的表达水平在治疗前后与CD+4T细胞计数均呈显著正相关，与病毒载量呈明显负相关，提示PD-1/PD-L1负性抑制途径在疾病进展中起着一定的作用。

综上所述，HIV外周血PD-1/PD-L1表达水平与疾病进展密切相关，尽管现在仍有许多不明地方有待解决，但相信随着PD-1/PD-L1调节机制及其抗病毒免疫关系的进一步阐明，该通路信号可作为很有治疗前景的靶位。

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