疾病监测, 2014, 29(2): 98-100
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2014.02.005
Detection of Neisseria meningitidis serogroup B belonging to ST4821 complex in Beijing
DONG Mei1, ZHAO Jian-hong2, WANG Heng-wei2, ZENG Yang1, HUANG Fang1, WU Jiang1
1. Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China;
2. Chaoyang District Centre for Disease Control and Prevention of Beijing, Beijing 100021, China
Abstract
Objective To understand the etiological and molecular epidemiological characteristics of a death case of meningococcal disease in Beijing in January 2013. Methods Cerebrospinal fluid (CSF) and blood samples were collected from the case for pathogen isolation. The isolated strain was detected with real-time fluorescence quota polymerase chain reaction (PCR) and multi locus sequence typing (MLST). Outer membrane protein PorA, FetA genes were detected to identify the isolated strain. Drug susceptibility test to 12 antibiotics was conducted. Results Specific gene ctrA of N. meningitidis and serogroup B-specific gene siaD were detected from the CSF and blood samples. One strain of N.meningitidis was isolated from CSF and no N. meningitidis strains were isolated from throat swabs of the close contacts. The isolate belonged to serogroup B according to bacteriologocal and serological detection results, which was supported by the results of PCR. The MLST analysis indicated that the sequence type of the isolate from the case was ST10051, belonging to ST4821 complex. The PorA and FetA alleles of the strain were P1.20,23-9 and F1-91 respectively. The strain was sensitive to 9 antibiotics except for trimethoprim-sulfamethoxazole,ciprofloxacin and tetracycline. Conclusion The isolate reported had a phenotype of B: P1.20, 23-9: F1-91:ST-10051 (cc4821) which is high pathogenic and had caused infection even death. It is necessary to fully understand the carriage and infection status of N. meningitidis in Beijing.
Keywords:    meningococcal disease   Neisseria meningitidis serogroup B   ST4821 complex   death case  

北京发现ST4821克隆群B群脑膜炎奈瑟菌
董梅1, 赵剑虹2, 王恒伟2, 曾阳1, 黄芳1, 吴疆1
1. 北京市疾病预防控制中心免疫预防所,北京 100013;
2. 北京市朝阳区疾病预防控制中心,北京 100021
收稿日期：2013-11-29
作者简介：董梅，女，山西省万荣县人，副主任技师，博士，主要从事疫苗相关传染病病原检测和研究工作
通讯作者：吴疆，Tel：010-64407107，Email：wj81732@yahoo.com.cn
摘要
目的 对2013年1月北京市1例流行性脑脊髓膜炎（流脑）死亡病例标本进行脑膜炎奈瑟菌检测，了解感染病原及分离菌株的分子流行病学特征。方法 对患者脑脊液标本进行细菌分离培养，通过常规细菌学试验对分离菌株进行脑膜炎奈瑟菌鉴定、实时荧光定量-聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative PCR）方法检测患者脑脊液和抗凝血中脑膜炎奈瑟菌核酸，同时对鉴定的菌株进行多位点序列分型（MLST）分析、外膜蛋白PorA分型和FetA分型，以及体外药物敏感试验。结果 从患者脑脊液和抗凝血标本中均检测到脑膜炎奈瑟菌种特异基因ctrA和血清群B特异基因siaD。从患者脑脊液中分离到1株可疑阳性菌，经实验确诊为B群脑膜炎奈瑟菌。PorA为P1.20，23-9，FetA为F1-91；多位点序列分型分析显示基因型为ST10051，属于ST4821序列群。该菌株对复方新诺明为中等耐药，对环丙沙星和四环素耐药，对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、左氧氟沙星、美罗培南、氯霉素、利福平等药物均敏感。从密切接触者咽拭子中未分离到脑膜炎奈瑟菌。结论 该菌株经鉴定为B：P1.20，23-9：F1-91：ST10051（ST4821序列群）。北京地区人群中已经存在高致病性ST4821克隆群B群脑膜炎奈瑟菌，并引发死亡病例，提示应全面掌握本地区脑膜炎奈瑟菌健康人群携带情况及病例菌株分子流行病学资料，为流脑的预防控制提供实验室数据支撑。
关键词:    流行性脑脊髓膜炎   B群脑膜炎奈瑟菌   ST4821序列群   死亡病例  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 病历资料
1.2 标本
1.3 试剂和仪器
1.4 方法
1.4.1 细菌学和血清学鉴定
1.4.2 核酸检测
1.4.3 MLST
1.4.4 药物敏感性试验
2 结果
2.1 细菌分离培养和鉴定结果
2.2 血清分群结果
2.3 MLST分子分型结果
2.4 药物敏感性试验结果
3 讨论
　　20世纪80年代之前，中国发生过多次流行性脑脊髓膜炎(流脑)全国大流行，流行菌群为A群[1]，后经大范围疫苗接种，发病率逐年递减。进入21世纪，该病流行状况发生改变，自2003年安徽地区暴发C群流脑以后，我国流脑流行的优势菌群为A群和C群共存[2]。虽然B群脑膜炎奈瑟菌(Nm)在全球多个国家和地区引起流脑暴发流行[3]，但是B群Nm在我国仅引起少数散发病例。据监测资料显示，我国健康人群Nm携带以B群为主。随着流脑疫苗大面积应用，流脑发病率明显下降，2005年以来，北京地区流脑发病率一直维持在0.5/10万以下的低水平，既往报告的流脑病例一直以A群和C群为主[4]，B群很少引起发病。2009年北京地区曾经出现过1例B群流脑病例，此后至2012年本地区未发现B群流脑病例。2013年1月1日，北京市朝阳区疾病预防控制中心(CDC)报告1例流脑死亡病例，1月4日实验室从其脑脊液标本中分离出1株可疑阳性菌，经鉴定为B群脑膜炎奈瑟菌，进一步 多位点序列分型(Multi Locus Sequence Typing，MLST)结果为ST10051，属于ST4821高致病性序列群。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 病历资料
　　该患者为河南籍10月龄男婴，来京2个月，与父母居住在朝阳区一间出租平房内，室内通风不佳。患儿无流脑疫苗接种史，无流脑病例接触史，于2012年12月25日夜间无明显诱因出现发热、烦躁、精神不振，继而于12月26日下午出现皮肤出血点。家长带患儿前往地区诊所和某医院就诊，因患儿病情较重转上级医院就诊，查血常规：WBC 9.87×109/L，中性粒细胞比率74.5%；脑脊液检查：外观微混，蛋白1518.4 g/L，WBC 251个/μl，葡萄糖 3.12 mmol/L，氯化物 102 mmol/L。查体显示患儿昏迷，起病急，全身淤点淤斑密集，下身淤点淤斑融合成片，曾出现抽风惊厥，查体有颈项强直、意识障碍、前囟隆起、巴氏征阳性。患儿病情发展迅速，病情严重，经抢救无效，于2013年1月1日死亡。
1.2 标本
　　脑脊液、抗凝血为北京市朝阳区CDC送检的病例标本。
1.3 试剂和仪器
　　巧克力平板和血平板 ；API NH生化鉴定试剂盒(Bio-Merieux公司，法国)；Remel脑膜炎奈瑟菌参考诊断血清(美国)；细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司，德国)；脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative PCR)检测试剂盒(江苏和创生物科技有限责任公司，中国)；实时荧光定量PCR仪(ABI 7500 Fast Real-Time PCR System，美国)；Taq DNA聚合酶(Promega公司，美国)；7对看家基因及PorA， FetA扩增引物和测序引物参照PubMLST(www.pubmlst.org/neisseria)，由生工公司合成；测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。Etest试条(AB BIOMERIEUX公司，瑞典)。
1.4 方法
1.4.1 细菌学和血清学鉴定
　　将待检标本无菌接种于巧克力平板和血平板，5%CO2培养箱中37 ℃孵育24 h后，挑取可疑菌落：灰白色、半透明、边缘整齐、不溶血小菌落在血平板上进行纯培养，染色镜检，观察细菌形态。革兰阴性菌通过氧化酶试验，生化鉴定(NH试纸条)进行细菌学鉴定；通过血清凝集试验进行血清分群。
1.4.2 核酸检测
　　按照DNA提取试剂盒说明书提取脑脊液、抗凝血中细菌基因组DNA，用多重实时荧光定量PCR方法检测分离菌株的脑膜炎奈瑟菌种特异基因ctrA和群特异基因，进行核酸检测确定血清群。按照试剂盒说明书操作，20 μl反应体系，循环条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，56 ℃50 s，72 ℃ 15 s,共40个循环；在退火阶段检测荧光信号，同时设立A群参考菌株对照及试剂盒阳性对照和阴性对照。
1.4.3 MLST
　　对分离鉴定的菌株提取核酸后，根据PubMLST网站提供的方法和引物分别扩增脑膜炎奈瑟菌7种看家基因，同时扩增PorA和FetA基因，并将结果测序。测序结果在网站中进行比对，确定其ST型及相应序列群。
1.4.4 药物敏感性试验
　　用Etest试条体外检测该分离菌株对12种抗菌药物敏感性。严格按照说明书操作。测定其对青霉素、氨苄西林、美罗培南、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、米诺环素、阿奇霉素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星、甲氧苄啶/磺胺12种抗菌药物最低抑菌浓度。
2 结果
2.1 细菌分离培养和鉴定结果
　　从患者脑脊液标本中分离到1株脑膜炎奈瑟菌。细菌镜检为革兰阴性双球菌、氧化酶试验阳性、API NH生化鉴定结果符合脑膜炎奈瑟菌生化特征。
2.2 血清分群结果
　　鉴定的菌株血清凝集试验为B群血清凝集；多重实时荧光定量PCR从细菌提取核酸中检测到ctrA和siaD 基因，为B血清群。两种方法检测结果一致。
2.3 MLST分子分型结果
　　将7个看家基因扩增产物测序结果与国际MLST网络数据库中N.meningitidis菌株序列比对后，得到的等位基因值分别为abcZ 222；adk 3；aroE 58；fumC 1：gdh 386；pdhC 18：pgm 255。根据获得的等位基因数值，在国际MLST网络数据库中查询得到该菌株为ST 10051，属于cc4821克隆群。外膜蛋白PorA分型为VR1 20， VR2 P23-9， FetA分型为F1-91。
2.4 药物敏感性试验结果
　　根据2011年美国CLSI抗微生物药物敏感性试验的脑膜炎奈瑟菌最小抑菌浓度解释标准进行判断，该菌株对复方新诺明为中等耐药，对环丙沙星和四环素耐药，对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、左氧氟沙星、美罗培南、氯霉素、利福平等药物均敏感。
3 讨论
　　从患者的脑脊液、抗凝血中均检测到脑膜炎奈瑟菌种特异基因ctrA和血清群B特异基因siaD，并从脑脊液中分离到B群脑膜炎奈瑟菌，为病例确诊提供可靠的病原学证据。结合临床症状、流行病学调查和实验室检测，最终确诊为由B群脑膜炎奈瑟菌引起的流脑死亡病例。这是2010年以来北京发现的唯一B群流脑病例。患儿除同父母去菜市场外，一直生活在出租屋内，采集病例密切接触者咽拭子进行检测，并未分离到可疑阳性菌株。
　　疫苗的应用大大降低了流脑的发病率，但目前流脑疫苗仅有A、C、W135和Y群单价/多价多糖疫苗或多糖蛋白结合疫苗，尚无有效的B群流脑疫苗，人群对B群流脑存在免疫屏障空白，这可能是近些年B群流脑发病增多的原因之一。提示，A群和C群以外的其他血清群和不可分群流脑更应该引起关注。
　　荚膜转换是细菌逃避宿主免疫应答的普遍机制。广泛接种流脑疫苗降低发病率和死亡率的同时对脑膜炎奈瑟菌造成选择压力，脑膜炎奈瑟菌可能发生荚膜转换等变异，出现新的致病性克隆群。ST4821是我国主要流行克隆群，其血清群多为C群[5]，而本研究患者病原菌为B群ST4821克隆群，且致病力强，造成患者死亡，提示该高致病性克隆群已在本地人群中存在并传播，需要密切关注本地区流脑菌株分子流行病学信息。B群流脑疫苗缺失，人群对B群流脑的免疫空白以及脑膜炎奈瑟菌的易变性为B群流脑暴发甚至局部流行提供了可能性。因此，在进行脑膜炎奈瑟菌流行病学研究时，应结合血清学和分子生物学方法，全面了解病原的特征，以便更准确地进行溯源和追踪。

参考文献
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[2] Zhou H, Gao Y, Xu L, et al. Distribution of serogroups and sequence types in disease-associated and carrier strains of Neisseria meningitidis isolated in China between 2003 and 2008[J]. Epidemiol Infect,2012,140(7):1296-1303.  
[3] Rabab ZJ, Asad A, Nancy EM, et al. Global epidemiology of invasive meningococcal disease[J]. Popul Health Metr,2013,11(1):17.
[4] Zhang TG, He X, Chen LJ, et al. Surveillance on pathogens of meningococcal meningitis in Beijing,2005[J]. Chinese Journal of Epidemiology,2006,27(5):396-398.(in Chinese)张铁钢,贺雄,陈丽娟,等. 北京地区2005年流行性脑脊髓膜炎病原学监测[J].中华流行病学杂志,2006,27(5):396-398.
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