1. Institute of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421000, Hunan, China;
2. Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, Beijing 102206, China;
3. Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Hangzhou 310003, Zhejiang, China

Objective To analyze the molecular characteristics of drug-resistance associated genes of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). Methods Drug-resistant associated genes of inhA, katG, oxyR-ahpC (isoniazid), rpoB (rifampicin), gyrA (ofloxacin) and rrs (kanamycin) of 138 MDR-TB strains and 45 sensitive strains isolated in China were detected. Results Among 138 MDR-TB strains, 14.4% had mutations in inhA, 72.5% had mutations in katG, and 15.9% had mutations in oxyR-ahpC. The detection rate of the drug resistant mutations to isoniazid of the 3 gens mentioned above was 90.6%. 94.2% had rpoB mutation, 74.5% had gyrA mutation, and 61.1% had rrs mutation. The majority of mutations were at katG315 (66.7%), inhA-15 (9.4%), oxyR-ahpC-10 (5.1%), rpoB516 (13.8%), 526 (26.1%), 531(49.3%), gyrA90 (21.6%), 94 (51%) and rrs1401 (61.1%). Conclusion The most common gene mutations associated with isoniazid, rifampicin, ofloxacin and kanamycin resistance in MDR-TB strains in China were at katG315, inhA-15, rpoB516, 526, 531, gyrA90, 94 and rrs1401, respectively.

Keywords:    Mycobacterium tuberculosis   multi-drug resistance   gene   mutation  

1. 南华大学病原生物学研究所, 湖南 衡阳 421000;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
3. 感染性疾病诊治协同创新中心, 浙江 杭州 310003

收稿日期：2014-2-16

基金项目：国家自然科学基金（No.81201348）；国家科技重大专项（No.2013ZX10003002-001）

通讯作者：万康林，Tel：010-58900776，Email：wankanglin@icdc.cn

目的 了解中国耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因的分子特征。方法 对138株耐多药结核分枝杆菌和45株敏感菌的耐药相关基因inhA、katG和oxyR-ahpC间隔区（异烟肼）、rpob（利福平）、gyrA（氧氟沙星）和rrs（卡那霉素）进行序列测定，分析其基因突变特点。结果 138株耐多药结核分枝杆菌中，14.4%的菌株inhA基因发生突变，72.5%菌株的katG基因发生突变，15.9%菌株的oxyR-ahpC基因发生突变，同时考虑这3种基因，异烟肼耐药相关基因突变检出率可达90.6%；94.2%菌株的rpoB基因发生突变，74.5%菌株的gyrA基因发生突变，61.1%菌株的rrs基因发生突变，主要的突变位点为katG315（66.7%），inhA-15（9.4%），oxyR-ahpC-10（5.1%），rpoB516（13.8%），526（26.1%）和531（49.3%），gyrA90（21.6%）和94（51%），rrs1401（61.1%）。结论 我国耐多药结核菌异烟肼、利福平、氧氟沙星和卡那霉素耐药相关基因最常见突变为katG315、inhA-15，rpoB531、526和516，gyrA94和90，rrs1401。

关键词:    结核分枝杆菌   耐多药   基因   突变  

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.2 标本来源

1.3 DNA模板的制备

1.4 PCR扩增及序列测定

2 结果

2.1 异烟肼

2.2 利福平

2.3 氧氟沙星

2.4 卡那霉素

3 讨论

中国是耐药结核病严重流行的国家之一。据最新的全国结核病耐药基线调查数据显示：我国肺结核患者中耐多药率为8.32%，广泛耐药率为0.68%^[1]。据此估算，我国每年新发耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB，指结核分枝杆菌至少对异烟肼和利福平两种药物耐药)患者12万例，广泛耐药结核病(extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB，指耐多药结核菌对任意1种氟喹诺酮类药物、3种二线注射药物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星中至少1种耐药)患者9000例。MDR-TB尤其是XDR-TB是结核病中最为严重、危害性最大的一类，具有治疗周期长、传染性强、治疗费用高、治疗效果差及死亡率高等特点，因此，MDR-TB及XDR-TB的出现和蔓延严重阻碍了我国结核病防治工作的进程。

以往的研究表明：结核分枝杆菌耐药通常与某些基因突变有关，但不同的国家和地区结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特点也会不同，尽管我国每年新发MDR-TB患者数量众多，但有关其耐药相关基因的研究数据较少。本研究详细分析了我国138株MDR-TB的异烟肼耐药相关基因inhA、katG和oxyR-ahpC；利福平耐药基因rpoB；氧氟沙星耐药基因gyrA和卡那霉素耐药基因rrs的突变特点。

本试验所涉及的183株结核分枝杆菌临床分离株(138株耐多药菌株和45株敏感菌)均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室传代、培养和保存。

采用比例法进行药物敏感性实验，含药培养基内药物终浓度分别为异烟肼0.2 μg/ml、利福平40 μg/ml、氧氟沙星2.0 μg/ml和卡那霉素30 μg/ml^[2]。4种药物均为美国Sigma公司产品。

采用CTAB法^[3]提取结核分枝杆菌DNA。

聚合酶链反应(PCR)引物序列见表1，采用50 μl反应体系。反应参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，然后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检验后送北京擎科生物技术有限公司测序。

表1 PCR反应引物及目标片段位置
Table 1 PCR primer sequences and target gene fragments in M. tuberculosis

基因

引物名称

引物序列 (5′~3′)

位置

片段大小 (bp)

InhA	Inh A-F	TGC CCA GAA AGG GAT CCG TCA TG	1673278~1673732	455
	Inh A-R	ATG AGG AAT GCG TCC GCG GA
katG	kat G-F	AAC GAC GTC GAA ACA GCG GC	2154886~2155340	455
	kat G-R	GCG AAC TCG TCG GCC AAT TC
oxyR-ahpC	oxyR-ahpC-F	GAG ACC GGC TTC CGA CCA CC	2725943~2726235	293
	oxyR-ahpC-R	GCT GGT AGG CGG GGA ATT GAT
rpoB	rpoB-F	CTT GCA CGA GGG TCA GAC CA	760829~761371	543
	rpoB-R	ATC TCG TCG CTA ACC ACG CC
rrs	rrs-F	GTC CGA GTG TTG CCT CAG G	1473003~1473518	516
	rrs-R	GTC AAC TCG GAG GAA GGT GG
gyrA	gyrA-F	TCG ACT ATG CGA TGA GCG TG	7387~7801	415
	gyrA-R	GGT AGC ACC GTC GGC TCT TG

以H37Rv(ATCC 27294)作为阴性对照菌，使用个性化perl脚本对序列结果进行比对分析。

本次研究的183株结核分枝杆菌中，耐多药结核菌138株，敏感菌45株。138株耐多药结核菌中，39株菌二线药物仅对氧氟沙星耐药，6株菌仅对卡那霉素耐药，而既对氧氟沙星耐药又对卡那霉素耐药的菌有12株。

对异烟肼耐药相关基因katG、inhA和oxyR-ahpC间隔区检测后发现，在138株耐多药菌株中，100株发生了katG基因突变，均为单个点突变，其中92株为katG315的突变，见表2。katG突变主要是katG315 AGC－ACC(84%，84/100)。InhA基因突变主要发生在启动子区，研究发现20株inhA突变耐药菌中，13株发生(-15)C－T 突变，5株存在(-8)T－C 突变和2株其他启动子区突变。这些菌中，12株联合katG基因突变。oxyR-ahpC间隔区突变存在于22株耐药菌中，(-10) C－T较多见，6株耐药菌发生了此突变，还有其他一些突变，如(-15) C－T等(表2)。45株敏感菌中，1株可见inhA启动子区(-26)C－T突变。

利福平耐药主要由rpoB基因突变引起，本次实验扩增了543 bp相关片段，包含81 bp利福平耐药决定区，即密码子507~533区。研究显示，130株耐药菌发生了rpoB基因突变，其中108株为单位点突变，19株联合突变。这些突变中，128株菌突变位点位于利福平耐药决定区，最常见为531位点突变，检出率为49.3%(68/138)，其次，526位点检出率为25.4%(35/138)，516位点检出率为13.8%(19/138)。rpoB基因主要突变为rpoB 531 TCG-TTG,突变率为47.1%。45株敏感菌在扩增区域未检测出任何突变。

51株氧氟沙星耐药菌株中，38株检出gyrA突变，其中25株94位点突变，主要为gyrA 94 GAC-GGC，11株gyrA 90 GCG-GTG，1株91位点突变和1株94和91位点联合突变。敏感菌中未发现突变。

耐多药菌中有18株卡那霉素耐药，其中10株发生rrs基因突变，均为1401 A-G突变。

表2 异烟肼、利福平、氧氟沙星和卡那霉素主要耐药相关基因突变分析
Table 2 Drug-resistance associated gene mutations among MDR-TB isolates

本研究选取的138株耐多药菌中，51株耐多药菌对氧氟沙星耐药，占37.0%，18株耐多药菌对卡那霉素耐药，占13%，其中，广泛耐药结核占8.7%（12/138），这与我国2007-2008年结核病耐药基线调查数据一致^[1]。而除XDR外， pre-XDR（耐多药菌除异烟肼和利福平外只对氟喹诺酮和注射用二线药物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素4种药物中的1种耐药）存在着极大的发展为广泛耐药菌的风险，这些耐药主要是由于抗生素的滥用和不恰当的临床治疗方案引起^[4]，因此了解我国耐多药菌耐药分子特征对结核病，尤其是耐多药结核病的防治具有重大意义。

异烟肼耐药机制较为复杂，本次研究主要对耐药相关基因katG、inhA和oxyR-ahpC间隔区的分子特征进行了分析，结果显示：耐多药菌中katG基因突变高度集中，主要位于315位点，占katG基因突变的92%（92/100）。katG基因突变的检出率为72.5%（100/138），inhA基因检出率为14.5%（20/138）。综合考虑katG和inhA两种基因的突变情况，异烟肼耐药检出率可达到78.3%，这与江西等地区报道结果基本一致^[5]，但是低于美国、欧洲等地区（约90%）^[6-7]。另外，oxyR-ahpC间隔区突变的检出率为15.9%（22/138）。如果同时考虑这3种基因，异烟肼耐药检测的检出率可达到90.6%（125/138），与上海报道一致^[8]，提示oxyR-ahpC间隔区突变在我国耐多药菌中较常见，且异烟肼耐药相关基因的突变特征存在区域性差异。

利福平耐药分子机制比较明确，主要由rpoB基因突变引起。本研究结果显示，rpoB基因突变的检出率高达94.2%（130/138），这与我国江西及美国、欧洲等地区的报道基本一致^[5-7]。130株发生突变的耐多药菌中，突变主要发生在531、526和516位点，占全部rpoB基因突变的91.5%（119/130）。由此可见，通过检测rpoB基因突变来检测结核分枝杆菌利福平耐药的可靠性很高。这对解决比例法药敏试验耗时过久是一个重要的备选方案。另外还有未检测出rpoB突变的耐药菌，可能存在rpoB基因上扩增区域外的突变或是由其他基因，如rpoC基因突变引起。

氧氟沙星是重要的二线抗结核药物，尤其是对耐多药结核病具有较好的疗效。氧氟沙星的耐药主要机制是gyrA基因突变。本研究中，gyrA基因突变检测的检出率为74.5%，证明了这一观点^[9-11]。gyrA基因突变主要发生在94和90位点，少数发生在91位点，主要突变为gyrA 94 GAC-GGC和gyrA 90 GCG-GTG。此外，25.5%氧氟沙星耐药菌未发现gyrA突变，因此，除了gyrA基因突变外，其他机制，如gyrB基因突变、药物主动外排出现和膜的通透性减低等^[12-13]，可能与结核分枝杆菌对喹诺酮类药物耐药有关。但其确切相关性还需要进一步研究。

卡那霉素是另一种重要的抗结核治疗的二线药物。目前已知引起卡那霉素耐药的主要机制是rrs基因突变。本研究发现在卡那霉素耐药的耐多药菌中，rrs突变均为A1401G，未发现其他报道中出现的1402及1484位点的突变，A1401G突变的检出率为61.1%，稍低于国内外其他报道^[9,14]，这可能与地域性差异、样本选择以及样本量的大小等因素有关。此外，有报道表明rrsA1401G突变引起高水平的卡那霉素耐药^[15]。同时，我们需要进一步探索eis突变^[16]等其他可能引起卡那霉素耐药的机制，以利于研究建立更加完善的快速耐药检测方法。

本研究采用了基因测序的方法分析结核分枝杆菌临床分离株对异烟肼、利福平、氧氟沙星和卡那霉素耐药相关基因的特征，其相关基因突变检测的检出率分别为90.6%、94.2%、74.5%和61.1%。这些药物耐药相关的基因常见的突变为katG 315（66.7%）、inhA-15（9.4%）、oxyR-ahpC-10（5.1%）、rpoB 531（49.3%）、rpoB526（26.1%）、rpoB 516（13.8%）、gyrA94（51%）、gyrA90（21.6%）和rrs 1401（61.1%）。我国耐多药菌中，oxyR-ahpC间隔区突变的检出率较高，说明此基因在我国结核分枝杆菌异烟肼耐药分子学方法检测中具有重要价值。综上所述，我国耐多药结核分枝杆菌分子特征的分析为建立快速、准确的结核分枝杆菌药物敏感性检测方法和了解我国结核分枝杆菌流行病学提供了重要依据。

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