No.1 Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, Zhejiang, China

Objective To understand the drug resistance of extended spectrum β-lactamases (ESBLs) producing Escherichia coli strains isolated in our hospital and the relationship between genotype of ESBLs and the virulence factors of ESBLs producing E coli strains Methods PCR was conducted to amplify virulence factors such as papC, sfa/foc, afa/dra, hly, cnf1, iutA, aer, fimH, kpsMTⅡ, fyuA in 188E. coli strains isolated from inpatients in our hospital. ESBLs was detected with K-B disc diffusion method, the genotype of ESBLs and their distribution were detected by PCR. Results The detection rates of virulence factors iutA and fyuA were all >50%, the detection rats of fimH and aer were 20%-40%,but the detection rate of papC, sfa/foc, afa/dra and kpsMTⅡ were all <20%. There was no significant differences (P>0.05) in virulence factor distribution between ESBLs producing E. coli strains and non ESBLs producing. E. colistrains. Among the 92 ESBLs producing E. coli clinical isolates, the positive rate of papC in CTX-M-9 was higher than that in CTX-M-1 and TEM, the difference was statistical significant (P<0.05) and the positive rate of aer was higher in CTX-M-1 than in TEM and CTX-M-9, the difference was statistical significant (P<0.05). Conclusion The detection rate of virulence factor was not associated with ESBLs producing or not in E. coli, but ESBLs genotype was associated with virulence factor. Virulence factor might be associated with the drug resistance of CTX-M producing E. coli.

Keywords:    Escherichia coli   virulence factor   extended spectrum β-lactamases  

浙江省温州医科大学附属第一医院, 浙江 温州 325000

收稿日期：2014-1-22

通讯作者：徐春泉，Tel：0577-88069589，Email：spring830202@sohu.com

目的 分析温州医科大学附属第一医院临床分离产超广谱β-内酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamase，ESBLs）大肠埃希菌耐药情况，研究大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶的不同基因型与所含的毒力因子的关系。方法 普通聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测不同标本来源大肠埃希菌的毒力因子papC、sfa/foc、afa/dra、iutA、 aer、fimH、hly、cnf1、kpsMTⅡ、fyuA；纸片扩散确证法检测超广谱β-内酰胺酶，PCR方法检测ESBLs不同基因型的分布情况。结果 产ESBLs大肠埃希菌株中，毒力因子iutA、fyuA的检出率较高，均>50%；毒力因子fimH、aer的检出率为20%~40%，而毒力因子papC、sfa/foc、afa/dra和kpsMTⅡ的检出率均较低<20%；经χ²检验产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株的毒力因子分布率差异均无统计学意义（P>0.5）。92株产ESBLs大肠埃希菌中，毒力因子papC在CTX-M-9群中的阳性率高于TEM群和CTX-M-1群，差异有统计学意义（P<0.05）；毒力因子aer在CTX-M-1群中的阳性率高于TEM群和CTX-M-9群，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 各种毒力因子检出率与细菌是否产ESBLs无相关性。但ESBLs阳性菌株中不同的基因型与某些毒力因子的存在与否存在一定关系，毒力因子与产CTX-M酶大肠埃希菌耐药情况可能有关。

关键词:    大肠埃希菌   毒力因子   ESBLs  

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

1.1.2 主要试剂与仪器

1.2 方法

1.2.1 ESBLs表型检测

1.2.2 毒力基因及ESBLs基因检测

1.2.3 统计学处理

2 结果

2.1 大肠埃希菌产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株毒力因子分布

2.2 ESBLs基因PCR扩增结果及相关统计分析

2.2.1 对92株产ESBLs大肠埃希菌进行超广谱

2.2.2 不同基因型产ESBLs大肠埃希菌毒力因子分布

3 讨论

大肠埃希菌是临床上常见的致病菌，随着三代头孢菌素等广谱β内酰胺类抗生素在临床上的广泛应用，产超广谱β内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamase，ESBLs)大肠埃希菌感染日益增多。ESBLs由质粒介导，易在同种属甚至不同种属细菌间传递造成暴发流行，由于各个国家和地区使用的抗菌药物存在差异，流行的ESBLs基因型各不相同。ESBLs的传播性以及它们的多重耐药性给临床抗感染治疗造成了极大困难，及时准确检出ESBLs对防止ESBLs流行、控制院内感染和指导临床治疗有着非常重要的意义。

本研究对浙江省温州医科大学附属第一医院临床分离的产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的产生率、超广谱β-内酰胺酶的基因型及所含的毒力因子进行检测，分析ESBLs与毒力因子的相关性，为提高抗菌药物治疗的有效率提供依据。

188株大肠埃希菌为温州医科大学附属第一医院临床送检标本中分离得到，其中64株分离自尿液标本，62株分离自脓液标本，另62株分离自血液标本，全部菌株应用法国生物梅里埃公司产品VITEK 2 Compact型全自动微生物分析仪作菌种鉴定，均为非重复菌株。质控菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)和肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)分别为ESBLs检测的阴性和阳性质控菌株。

VITEK 2 Compact 全自动微生物分析仪及其配套的细菌鉴定和药敏检测卡(法国生物梅里埃公司)； LB液体培养基(OXOID公司)；PCR试剂(上海生工生物工程技术有限公司)；50×TAE电泳试剂为实验室自配；琼脂糖粉为西班牙进口分装。隔水式恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)；THZ-C恒温振荡摇床 (江苏太仓实验设备厂)；BECKMAN低温离心机(Beckman公司)；MyCycler Thermal Cycler 170-9703 PCR 扩增仪(BIO-RAD 公司)；紫外凝胶分析系统(SynGene公司)。

按CLSI推荐的标准纸片扩散确证法测定ESBLs。同时用大肠埃希菌(ATCC 25922)和肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)分别作阴性和阳性的质控对照。

采用聚合酶链反应(PCR)扩增。

(1)引物设计：参照文献^[1-4]，由上海生工生物工程技术有限公司合成。序列及预期PCR扩增产物大小见表1、2。

(2)模板制备：将血平板上过夜培养的单个菌落挑于含1 ml LB的1.5 ml EP管中，过夜培养，然后于沸水中煮 10 min，12 000 r/min离心 3 min，上清液作为模板。

(3)PCR反应体系及反应条件：反应体系(25 μl)：上、下游引物各 0.2 μmol/L，10×buffer缓冲液 2.5 μl，dNTP 100 μmol/L， Mg²⁺ 1.5 mmol/L，Taq酶1.0 U，模板2 μl，加灭菌ddH₂O至25 μl。

(4)基因PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s；52 ℃ 30 s；72 ℃延伸60 s；共30个循环，72 ℃再延伸10 min。扩增产物在含0.5 μg/ml EB的1.0%琼脂糖凝胶于1×TAE 中电泳, 紫外透射反射仪观察结果，由紫外凝胶分析系统进行分析。以出现预期产物大小的条带判为阳性。

表1 毒力基因PCR扩增的引物
Table 1 Primers for PCR amplification of virulence genes

基因类型

序列 (5′~3′)

预期产物大小(bp)

退火温度(℃)

papC	GTG GCA GTA TGA GTA ATG ACC GTT A	203	54
	ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A
sfa/foc	CTC CGG AGA ACT GGG TGC ATC TTA C	408	55
	CGG AGG AGT AAT TAC AAA CCT GGC A
afa/dra	GGC AGA GGG CCG GCA ACA GGC	592	60
	CCC GTA ACG CGC CAG CAT CTC
iutA	GGC TGG ACA TCA TGG GAA CTG G	302	58
	CGT CGG GAA CGG GTA GAA TCG
aer	TAC CGG ATT GTC ATA TGC AGA CCG	602	55
	AAT ATC TTC CTC CAG TCC GGA GAA G
fimH	TCG AGA ACG GAT AAG CCG TGG	506	58
	GCA GTC ACC TGC CCT CCG GTA
hly	AAC AAG GAT AAG CAC TGT TCT GGC T	1177	54
	ACC ATA TAA GCG GTC ATT CCC GTC A
cnf1	AAG ATG GAG TTT CCT ATG CAG GAG	498	52
	CAT TCA GAG TCC TGC CCT CAT TAT T
kpsMTⅡ	GCG CAT TTG CTG ATA CTG TTG	270	53
	CAT CCA GAC GAT AAG CAT GAG CA
fyuA	TGA TTA ACC CCG CGA CGG GAA	785	58
	CGC AGT AGG CAC GAT GTT GTA

表2 ESBLs基因PCR扩增引物
Table 2 Primers for PCR amplification of ESBLs genes

引物名称

引物序列

扩增产物大小(bp)

退火温度(℃)

TEM	P1: ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA P2: GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC A	1080	52
SHV	P1: GGT TAT GCG TTA TAT TCG CC P2: TTA GCG TTG CCA GTG CTC	865	57
VEB	P1: CGA CTT CCA TTT CCC GAT GC P2: GGA CTC TGC AAC AAA TAC GC	643	50
PER	P1: ATG AAT GTC ATT ATA AAA GC P2: AAT TTG GGC TTA GGG CAG AA	925	50
GES	P1：ATG CGC TTC ATT CAC GCA C P2：CTA TTT GTC CGT GCT CAG G	864	54
CTX-M-1	P1: AAA AAT CAC TGC GTC AGT TCA C P2: ACA AAC CGT TGG TGA CGA TT	867	56
CTX-M-2	P1: TTA ATG ATG ACT CAG AGC ATT C P2: GAT ACC TCG CTC CAT TTA TTG	902	55
CTX-M-8	P1: ACA TCG CGT TAA GCG GAT P2: AAC CCA CGA TGT GGG TAG C	691	55
CTX-M-9	P1: TAT TGG GAG TTT GAG ATG GT P2: TCC TTC AAC TCA GCA AAA GT	933	53
OXA-10	P1: GTC TTT CGA GTA CGG CAT TA P2: ATT TTC TTA GCG GCA ACT TAC	720	51

采用四格表资料的χ²检验分析，应用SPSS 13.0软件进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

产ESBLs大肠埃希菌株中，毒力因子iutA、fyuA的检出率较高，均>50%；毒力因子fimH、aer的检出率为20%~40%，而毒力因子papC、sfa/foc、afa/dra、kpsMTII的检出率均较低<20%；经χ²检验产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株的毒力因子分布率差异均无显著性(P>0.5)，见表3。

β-内酰胺酶基因TEM、SHV、VEB、PER、GES、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、OXA-10检测，其中共检测到ESBLs基因阳性85株，检出率为92.4%。85株ESBLs基因阳性菌株中有64株携带CTX-M-9型基因，32株携带CTX-M-1型基因，23株携带TEM型基因，1株携带SHV型基因，其基因分布见表4，其余基因均未检出。基因电泳结果见图1。

表3 大肠埃希菌产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株的毒力因子分布
Table 3 Distributions of virulence factors of ESBLs producing E. coli strains and non ESBLs producing E. coli strains

毒力 因子

产ESBLs菌株(92株) 阳性株 阳性率 (%)

不产ESBLs菌株(96株) 阳性株 阳性率 (%)

papC	12	13.0	12	12.5
sfa/foc	6	6.5	6	6.3
afa/dra	3	3.2	6	6.3
iutA	54	58.6	57	59.4
aer	36	39.1	38	39.6
fimH	19	20.6	21	21.9
kpsMTII	3	3.2	8	8.3
fyuA	57	61.9	51	53.1

表4 85株产ESBLs大肠埃希菌的ESBLs基因型分布
Table 4 Distribution of ESBLs genotyes of 85 strains of ESBLs producing E. coli

基因型

菌株数

构成比(%)

TEM	3	3.5
SHV	1	1.2
CTX-M-1	15	17.6
CTX-M-9	35	41.2
TEM+CTX-M1	2	2.4
TEM+CTX-M9	14	16.5
CTX-M-9+CTX-M-1	11	12.9
TEM+CTX-M-9+CTX-M-1	4	4.7
合计	85	100.0

注1~4分别为TEM：1080 bp、 SHV：865 bp、CTX-M-1：867 bp、CTX-M-9：933 bp，M为Marker。
图1 不同基因型PCR扩增产物琼脂糖电泳结果
Figure 1 Agarose electrophoresis results of PCR amplification products of different genotypes

对9种毒力因子在85株ESBLs基因阳性菌株中的检出率进行分析，见表5。毒力因子papc在CTX-M-9基因阳性菌株中的检出率为21.9%，高于其在TEM基因阳性菌株及CTX-M-1基因阳性菌株中的检出率；而毒力因子aer在CTX-M-1基因阳性菌株中的检出率则要高于其在CTX-M-9基因阳性菌株及TEM基因阳性菌株中的检出率；毒力因子fyuA在CTX-M-9基因阳性菌株及CTX-M-1基因阳性菌株中的检出率则要高于其在TEM基因阳性菌株中的检出率。经 χ²检验差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 不同亚型ESBLs大肠埃希菌毒力因子分布率
Table 5 Distribution of virulence factors of E. coli with different subtypes of ESBLs

毒力 因子	TEM		CTX-M-9		CTX-M-1
	标本数	构成比 (%)	标本数	构成比 (%)	标本数	构成比 (%)

papC	1	4.3		14	21.9		0	0.0
sfa/foc	0	0.0		0	0.0		0	0.0
afa/dra	1	4.3		0	0.0		0	0.0
iutA	10	43.4		35	54.7		12	37.5
aer	7	30.4		28	43.8		20	62.5
fimH	7	30.4		14	21.9		10	31.2
kpsMTII	2	8.7		3	4.7		0	0.0
PAI	0	0.0		0	0.0		0	0.0
fyuA	11	47.8		50	78.1		23	71.9

大肠埃希菌是导致各种医院内感染的重要病原菌，近年来，随着广谱抗菌药物尤其是第三代头孢菌素在临床上的广泛应用，使大肠埃希菌等革兰阴性菌对其耐药性迅速增加，其中重要原因是产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。ESBLs的出现给临床抗感染治疗带来众多问题：如患者住院时间延长，治疗经费增高，死亡率上升，院内感染概率升高等。产ESBLs大肠埃希菌对大多数广谱β-内酰胺类抗生素高度耐药，对喹诺酮类、氨基甙类、磺胺类药物多重耐药。自20世纪80年代ESBLs细菌引起的感染流行以来，该类细菌流行逐年上升，特别是肠杆菌科细菌,是目前临床治疗的难题之一。

本实验188株大肠埃希菌中检出产ESBLs菌株92株，占48.9%(92/188)，高于黄印启等^[5]报道的数据。说明不同时间、不同地区，由于抗菌药物的使用种类和使用量不同等原因，ESBLs的检出率存在差异。

按遗传学特性分类，可将ESBLs分为5类，TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他。现已发现ESBLs基因型近200种，其中CTX-M型36种，它是由质粒介导产生的A类β内酰胺酶，于1989年首次德国和阿根廷自大肠埃希菌分离，具有ESBLs一般特性，其特点为对CTX的水解活性远高于头孢他啶，而命名为头孢噻肟酶。由于各地区抗生素的使用策略不同，各国家、地区所分离的占优势的ESBLs耐药基因型也不尽相同^[6-8]。CTX-M型酶在南美、东亚和东欧地区流行。早期中国大陆地区以CTX-M-3和CTX-M-14为主，其他类型较少见^[9-10]，但近年来随着细菌耐药情况的变化，有报道浙江地区以CTX-M-15为主^[11]。本实验结果显示：85株ESBLs基因阳性大肠埃希菌中CTX-M-9群比例最高(64株)占75.3%，TEM群(23株)占27.1%，CTX-M-1群(32株)占37.6%，SHV群(1株)占1.2%。未检测到基因型CTX-M-2型，CTX-M-8型，VEB型，GES(IBC)型及OXA-10存在。说明浙江省温州医科大学附属第一医院CTX-M-9酶流行较严重，与以往报道不相一致，这种ESBLs分离率的差异可能与不同医院、地区使用三代头孢菌素的种类数量及时间不同而造成对ESBLs的筛选及诱导不同有关，所以不同地区基因型的差异也可能与不同的质粒参与介导ESBLs基因转移有关。

近年来，大肠埃希菌毒力因子的研究已成为越来越受关注的话题 。Karisik等^[14] 曾对产CTX-M型ESBLs及不产ESBLs的大肠埃希菌的毒力基因进行检测，发现毒力基因fimH、fyuA、iutA、kpsMTII、traT等在产CTX-M型ESBLs及不产CTX-M型ESBLs大肠埃希菌中有差异，在产CTX-M型ESBLs中检出率高。但国内尚未报道产ESBLs大肠埃希菌的毒力因子情况。本研究结果显示：产ESBLs大肠埃希菌株中， 毒力因子pap、sfa/foc、afa/dra、kpsMTII的检出率均较低，而毒力因子fimH、iutA、aer检出率较高；同时，非ESBLs大肠埃希菌株中，papC阳性株占12.5%，sfa/foc 阳性株占6.3%，kpsMTII阳性株占8.3%，afa/dra阳性株占6.3%,均较低，iutA阳性株占59.4%，aer阳性株占39.6%，fimH阳性株占21.9%， fyuA阳性株占53.1%,要高于上述毒力因子，但产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株的毒力因子分布率差异均无统计学意义(P>0.5)。可见ESBLs的表型跟各个毒力因子的存在与否无关。表4显示ESBLs不同基因型毒力因子的分布情况,结果显示：毒力因子papc在CTX-M-9基因阳性菌株中的检出率为21.9%，高于其在TEM基因阳性菌株及CTX-M-1基因阳性菌株中的检出率；而毒力因子aer在CTX-M-1基因阳性菌株中的检出率则要高于其在CTX-M-9基因阳性菌株及TEM基因阳性菌株中的检出率；毒力因子fyuA在CTX-M-9基因阳性菌株及CTX-M-1基因阳性菌株中的检出率则要高于其在TEM基因阳性菌株中的检出率，差异有统计学意义。ESBLs不同基因型毒力因子分布存在差异性，毒力因子是否与产ESBLs的大肠埃希菌耐药有一定关系，有待进一步研究。

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