非伤寒沙门菌是引起感染性腹泻的重要病原之一，患者除了胃肠道症状外，有时会出现类伤寒样症状、败血症、局部化脓感染等。本病发病呈全球性分布，虽然准确的感染病例数不清楚，但据报道每年约有15万人死于此病^[1]。而且近年来发病率明显上升，加之这些菌对多种抗生素耐药，因此越来越受到各方的重视。对于健康人群，摄入大量的非伤寒沙门菌才能引起疾病，而一般幼儿和老年人以及慢性疾病患者则很容易感染，且症状严重，尤其 < 1岁婴幼儿由于免疫功能尚未成熟，所以更易于感染。我国近年几次婴幼儿腹泻病原菌调查显示沙门菌是细菌性腹泻的主要病原微生物^{[2, 3]}。食物传播为引起人类沙门菌感染的主要途径，但对于婴幼儿主要为直接接触或通过污染用具传播沙门菌，此种传播方式可见于医院中，以婴儿室、儿科病房较为常见。本研究在2013年5-10月收集了上海复旦大学附属儿科医院的583份住院和门诊的腹泻婴幼儿粪便标本，进行了沙门菌的分离培养，分子分型和药物敏感性实验，以分析研究婴幼儿感染的非伤寒沙门菌的分子流行病学特点和耐药情况，为临床治疗和疾病预防提供科学依据和指导。

2013年从上海复旦大学附属儿科医院收集婴幼儿粪便样本共583份，其中主要为门诊腹泻病例，也包括消化科等住院患者的腹泻粪便样本。

主要使用的仪器是脉冲场凝胶电泳仪(美国伯乐)，成像仪(美国伯乐)。主要试剂有木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(美国赛默飞世尔)沙门选择培养基(中国科马嘉)，API 20E生化试剂(法国梅里埃)，血清分型试剂(丹麦SSI)，MIC药敏板(中国天津金章)。

将肛拭子在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂上少量涂抹后划线，37 ℃培养过夜后，用一次性接种环取饱满透明的菌落直接涂布于沙门选择性培养基上，37 ℃培养过夜。挑取单个紫色菌落按照API 20E的使用说明书进行生化实验。

所有沙门菌依据国际实验室分子分型监测网络 PulseNet 中沙门菌 PFGE 分型标准化方案进行操作，主要包括细菌包埋、细菌裂解、胶块酶切、加样品、电泳、读胶等过程。使用限制性内切酶 XbaⅠ和BlnⅠ进行酶切，脉冲时间为2.16 s~63.8 s，获得的菌株 PFGE 图像录入 BioNumerics(Version 5.1，Applied maths，Inc.)软件进行处理，经校准后，使用非加权配对算术平均法(unweighted pair group average method，UPGMA) 进行聚类，构建聚类树，分析菌株间的相似性。

药敏试验采用最低抑菌浓度(MIC) 法。取过夜培养皿上数个新鲜菌落，混匀于1.5 ml细菌稀释液管中，调至0.5麦氏比浊浓度。接种后各孔中细菌含量达到1×10⁵cfu/ml左右。将接种后的试剂盒放置在37 ℃进行孵育。具体操作方法参见说明书。使用的抗生素有：氨苄西林(AMP)、奥格门丁(AMC)、头孢噻肟(CTX)、头孢三嗪(CRO)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻呋(CFT)、氯霉素(C)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(CN)、萘啶酸(NA)、链霉素(S)、磺胺甲恶唑(SMZ)、甲氧苄胺嘧啶(TMP)、复方新诺明(SXT)、四环素(TE)。结果判读按照临床和实验室标准化委员会(CLSI)颁布的最新标准(2013年版)进行。

药敏实验使用的质控菌株是大肠埃希菌ATCC25922，和铜绿假单胞菌ATCC27853。

583份婴幼儿粪便中分离出沙门菌共19株，阳性率为3.2%。其中 < 1岁的病例有4个，1~4岁的病例有10个，5个患儿年龄不详。另外，19例阳性病例4例来自传染科，1例来自消化科，1例来自血液科，剩余的13例均来自门诊，见图1、2。

图1 肠炎沙门菌PFGE图谱和相关信息 Fig. PFGE patterns and related information of Salmonella enterititis strains

图选项

图2 鼠伤寒沙门菌PFGE图谱和相关信息 Fig.2 PFGE patterns and related information of Salmonella typhimurium strains

图选项

分离得到的19株非伤寒沙门菌分为5个血清型，分别为肠炎(S. Enteritidis)、鼠伤寒(S. Typhimurium)、德尔比(S. Derby)、阿贡纳(S. Agona)、新加坡(S. Singapore)。其中肠炎沙门菌最多(10株)，其次为鼠伤寒沙门菌(6株)，其他血清型各1株。

用XbaⅠ限制性内切酶酶切时，19株菌共有14种PFGE带型，7株鼠伤寒沙门菌分别属于7种PFGE带型，9株肠炎沙门菌分为4种PFGE带型; 而用BlnⅠ酶切时，19株菌共有16种PFGE带型，7株鼠伤寒沙门菌分别属于7种PFGE带型，9株肠炎沙门菌分为6种PFGE带型。在本研究中，BlnⅠ限制性内切酶要比XbaⅠ分辨率高。这个差异主要体现在肠炎沙门菌，但通过病例信息比较，发现PFGE带型相同的菌株由于流行病学上没有关联的信息，因此认为这些菌株无相关性。

本研究中分离得到的菌株对15种抗生素有不同程度的耐药性，总体耐药率为78.95%(15/19)，其中菌株对萘啶酸(68.42%)和氨苄西林(63.20%)的耐药率较高，对环丙沙星(10.53%)和庆大霉素(10.53%)的耐药率较低，对4种三代头孢类抗生素(头孢噻肟、头孢三嗪、头孢他啶、头孢噻呋)的耐药率较高(40%)，MIC值均大于64 mg/L。各抗生素的耐药率见图3。另外，19株菌株耐药谱分布相对较广(13种耐药谱)，有2株对1种抗生素耐药，其余13株分别对4种或4种以上的抗生素有多重耐药的情况，见表1。不同的血清型和分子分型结果在耐药结果上无明显的差别。

图3 分离菌株对各种抗生素的耐药情况 Fig.3 Drug resistance of isolated strains

图选项

婴幼儿腹泻是严重危害婴幼儿健康发展的常见疾病之一，同时也造成了较大的社会经济负担。近些年，国内相关报道显示，沙门菌已成为婴幼儿细菌性腹泻的首要病原微生物，2012年四川省成都市对433例婴幼儿腹泻病原微生物监测分析结果显示肠道致病菌中沙门菌最多，占6.89%^[2]；2013年广东省中山地区492份婴幼儿腹泻样本中分离到沙门菌27株，也居细菌性腹泻病原微生物的首位^[3]。因此本研究对上海市引起婴幼儿感染性腹泻的沙门菌特点进行研究，对疾病的预防和控制工作具有重要意义。

在583份婴幼儿腹泻粪便样本中分离得到了19株沙门菌，进行血清学鉴定后发现均为非伤寒沙门菌，且主要为鼠伤寒和肠炎沙门菌(84.2%)。World Health Organization (WHO)和 Global Foodborne Infections Network(GFN)研究结果显示非伤寒沙门菌临床分离株80%为鼠伤寒和肠炎沙门菌^[4]，与本研究结果具有一致性。另外3种血清型在国内外婴幼儿腹泻沙门菌病例中都曾有过报道^{[5, 6]}，2005年发生在法国的阿贡纳沙门菌病暴发，波及104名婴儿，造成了严重危害。除做了血清分型外，本研究还用PFGE的方法对这些分离株进行了分子分型。从图1可以看到肠炎沙门菌带型相似性很高，与上海市近年肠炎沙门菌分子分型数据库相比较后，发现相同带型为上海市近年流行的主要PFGE型别(JEGX01_CN0001)。另外，发现用一种酶酶切时条带相同的菌株用另一种酶切时条带发生了变化，所以在用PFGE做溯源调查，暴发预警等工作时两种酶切是至关重要的。图2为鼠伤寒沙门菌的PFGE聚类分析图，可见菌株的多态性较高，与近年上海市鼠伤寒沙门菌带型情况不具有相似性。

近年来沙门菌耐药问题日趋严重^{[7, 8]}，2006-2012年上海市肠炎沙门菌耐药监测结果报道称低年龄组病例对三代头孢和环丙沙星耐药的菌株分别约占2/3 和1/2^[9]。本研究19株菌中有15株(78.95%)具有不同程度的耐药性，甚至有些菌株对14种抗生素具有耐药性。研究结果显示三代头孢类抗生素本研究中耐药性达到40%，同以往报道情况相似。另外，分离菌株对庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明耐药性较低，分析原因是以上3种抗生素因对婴幼儿具有肾毒性、耳毒性等副作用，在临床上为慎用或禁用药，所以相对敏感性较强。而氨苄西林、链霉素、氯霉素等临床使用较少的抗生素在研究中发现也存在耐药性，可能与畜牧业等滥用抗生素有关。除人为因素，细菌之间耐药性传递能力的增强也是原因之一。因此应加强抗生素耐药的监测，合理应用抗生素。

本研究中婴幼儿感染的非伤寒沙门菌耐药情况比较严重。不同血清型和分子分型的菌株耐药性差异无统计学意义。PFGE做溯源调查等工作时2种酶切至关重要。