柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)属于小RNA 病毒科肠道病毒属，共有 30 个血清型，包括A 组病毒的 24个血清型(A1~A24)和B组病毒的6个血清型(B1~B6)。其中柯萨奇病毒A组 16型(coxsakievirus A16，Cox A16)与肠道病毒71 型(enterovirus 71，EV71) 同为儿童手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD) 的主要病原，主要引起≤5岁婴幼儿出现手、足、口部疱疹、咽峡炎等症状，少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎等多种并发症。HFMD重症和死亡病例的病原构成主要为EV71，Cox A16只引起轻症患者，因此有关EV71 的流行病学和基因特征研究较为广泛，而对Cox A16关注较少。近年来，越来越多报道显示Cox A16感染除引起轻症外，亦可导致致死性心肌炎、脑干脑炎和肺炎等疾病^[1,2,3] 。作为肠道病毒，Cox A16的基因组只有一个开放读码框架(Open Reading Frame,ORF)，该ORF包含P1、P2和P3三个区，P1区负责编码病毒的结构蛋白VP1~VP4。其中VP1裸露于病毒外壳表面，是病毒主要的中和抗原决定簇所在部位，其核苷酸序列也是肠道病毒基因分型的主要依据^[4]。

为了解浙江省湖州地区Cox A16的流行情况及遗传特性，本研究对湖州地区2011-2012年HFMD疑似病例采集标本进行了肠道病毒核酸检测，并对本地区的Cox A16分离株进行了VP1 区序列测定和系统进化分析，为中国Cox A16流行株的基因特征研究积累基础数据。现将研究结果报告如下。

2011-2012年湖州市疾病预防控制中心(CDC)共收到来自3县2区CDC上送的HFMD疑似病例咽拭子标本538份，患者年龄范围在1月龄至12岁之间，主要集中在学龄前儿童。标本采集后-80 ℃保存备用。

采用QIAGEN公司病毒核酸提取试剂盒(QIAamp@Viral RNA Mini Kit)对咽拭子标本进行病毒RNA的提取。参照卫生部的《手足口病预防控制指南》(2009年版)，使用肠道病毒通用引物、EV71和Cox A16分型引物、探针(引物、探针由省CDC提供)对病毒RNA进行实时荧光定量反转录-聚合酶链反应 (real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)核酸检测。PCR反应试剂盒采用TaKaRa 公司的One step RT-PCR Kit (货号DRR064A)。反应条件为：42 ℃反转录30 min；95 ℃变性2 min； 95 ℃ 5 s、55 ℃ 35 s 扩增40个循环。

参照《手足口病预防控制指南》(2009年版)，选取Cox A16核酸检测阳性的咽拭子进行预处理，接种人横纹肌肉瘤细胞(RD)和人喉癌细胞 (Hep2)进行病毒分离。每天观察是否出现肠道病毒特征性的细胞病变效应(CPE)并记录，待CPE≥75%,收集病毒培养物并冷冻于-80 ℃，作为阳性分离病毒株。

选取2010年和2011年分离的Cox A16毒株，对其进行VP1区的序列扩增和测定。扩增引物参考文献合成^[5]：Cox A16-VP1-S,5′-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3′ (nt 2335~ 2354,参考株Cox A16/G-10)；COX A16-VP1-A,5′-GCT GTC CTC CCA CAC AAG AT-3′ (nt 3426 ~ 3445)。试剂采用TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit(货号DRR024A)，反应条件为：50 ℃反转录30 min；95 ℃预变性2 min； 95 ℃ 45 s、56 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。将有阳性条带的PCR扩增产物送大连宝生物工程有限公司测序。

利用DNAStar 7.0 的SeqMan软件对测序结果进行整理和拼接。应用Clustal W 软件对测序结果和Cox A16各型别参考序列进行多序列比对和分析，使用Mega 4.0软件绘制系统进化树，以明确本地区Cox A16的基因型别及其与国内外其他毒株的亲缘关系。用于系统发生分析的Cox A16参考株来自于 GenBank数据库。

2011-2012年湖州市3县2区按年度分别采集HFMD疑似病例咽拭子标本237份和301份。经real-time RT-PCR鉴定2011年肠道病毒核酸阳性174份，阳性率为73.4%(174/237)，其中EV71、Cox A16及其他肠道病毒的构成比分别为36.78%(64份阳性)、29.31%(51份阳性)、33.90%(59份阳性)；2012年肠道病毒核酸阳性221份，阳性率为73.42%(221/301)，其中EV71、Cox A16及其他肠道病毒的构成比分别为36.65%(81份阳性)、39.81%(88份阳性)、23.52%(52份阳性)。2011-2012年Cox A16和EV71共同构成了湖州地区HFMD的主要病原。

随机选取17株Cox A16阳性分离株进行VP1区的核苷酸序列测定和分析。2011年5株，2012年12株。电泳结果显示均扩增出片段大小为1110 bp的目的条带。测序结果经软件拼接后显示所测Cox A16毒株的VP1区核苷酸序列全长为891个核苷酸，编码297个氨基酸，未发现有核苷酸的缺失与插入。

17株Cox A16 VP1编码区全长序列间的核苷酸同源性为89.5%～100%，氨基酸同源性为99.3%～100%。将湖州地区Cox A16分离株与Cox A16各基因型的代表株以及近年来中国大陆其他省市的分离株进行序列比对和系统进化分析，结果见表 1和图 1。同源性分析结果显示: Cox A16湖州分离株与 A基因型代表株的核苷酸序列差异最大，B2基因亚型次之，与B1基因亚型的同源性最高，其中与B1a代表株和B1b代表株核苷酸同源性均大于90%。湖州分离株与各代表株之间在VP1 氨基酸序列同源性方面差别不大。

图 1 湖州地区Cox A16分离株的 VP1 区系统进化分析 Fig.1 Phylogenetic analysis on VP1 encoding sequence of Cox A 16 isolates

图选项

在系统进化树上，湖州地区的17株Cox A16均与B1基因型代表株聚为一簇。其中4株与2008年的青海分离株、2010年的河南分离株位于同一分支，属于B1a亚型；13株与2003年的北京分离株、2010年的浙江宁波分离株、2011年的深圳和湖北分 离株位于同一分支，属于位于B1b亚型。属于B1a 分支的4株湖州分离株与A、B1a、B1b 和B2 基因型代表株的核苷酸序列同源性分别为76.0%～76.8%、93.7%～94.2%、91.0%～91.8%、89.0%～89.6%；属于B1b分支的13 株湖州分离株与A、B1a、B1b 和B2 基因型代表株的核苷酸序列同源性为75.5%～77.1%、92.5%～93.9%、94.8%～96.1%、88.6%～89.3%。系统进化分型结果与同源性分析结果相符，说明湖州地区2011 2012年流行的Cox A16同时存在B1a和B1b两种基因亚型。

近年来，HFMD的流行在亚太地区呈上升趋势，主要由Cox A16和EV71引起的HFMD暴发席卷马来西亚、中国台湾、日本等地^[6,7,8]，我国各地区也持续存在由Cox A16和EV71交替或共循环所致HFMD流行^{[9, 10]}。本实验室从2008年开始开展HFMD疑似病例的病原学监测，监测数据表明湖州市HFMD的病原学检测结果与全国大部分地区类似。2009年湖州市HFMD的主要病原构成为EV71(63.73%)，2010年的主要病原转变为Cox A16(51.38％)^[11]，2011-2012年的主要病原则由Cox A16和EV71共同构成。HFMD患者在感染不同血清型EV后均可获得特异性免疫力，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同血清型病毒产生比较牢固的免疫力，本地区不同年代Cox A16和EV71的交替或共流行很可能与病毒自身的遗传进化规律及人群的免疫状态有关。

与EV71相比，Cox A16感染引起的大部分HFMD病例临床症状较轻，所以目前对Cox A16的流行病学和基因特征研究相对较少，尚无公认的Cox A16基因分型依据。2007 年Perera 等^[12]基于VP1 序列对亚太地区的Cox A16分离株进行了系统进化分析，认为不同基因型的VP1 差异应大于 15％，将Cox A16划分为A 和B 两个基因型，B基因型又分为B1 和B2 两个亚型。此后，我国的Zhang等^[5]学者也沿用此分型方法，并将 B1亚型又进一步分为B1a、B1b和B1c，其中B1a和B1b的核苷酸差异为6.5%。系统进化分析表明，目前A基因型只包含Cox A16的原型株G-10；1981-1998在日本以及1998-2000在马来西亚曾分离到B2基因亚型，2000年之后未见B2基因亚型的相关报道；B1基因亚型最早于1995年分离于日本，之后逐渐进化为全球流行的优势型别^[13]。已有的研究数据表明，B1c亚型的流行非常有限，1998年以来中国大陆及其周边的中国台湾、日本、泰国等国家分离的Cox A16毒株均属于B1a 和B1b 亚型^[5,13]。

通过对2011-2012年湖州地区有代表性的Cox A16分离株进行VP1基因全序列的测定，序列同源性比较和系统进化分析结果均表明湖州地区流行的Cox A16同样属于B1基因亚型，并且同时存在B1a和B1b两条进化分支，与1998年以来中国大陆优势株流行趋势完全一致，也与近年来国内其他地区报道的结果一致^{[14,15,16,17]}。同时两个进化分支中又细分为多条小分支，在进化关系上分别与同属于B1a亚型的青海、河南分离株以及B1b亚型的北京、湖北、深圳分离株有着较近的亲缘关系，提示存在多个传播链，并与国内其他省份流行的病毒在共同进化和循环。

1951年Cox A16首次被发现至今，经历了几十年的遗传进化，但其进化速率明显低于同属于肠道病毒的EV71和脊灰病毒，其VP1区的氨基酸序列具有更高的保守性。2011-2012年湖州市Cox A16分离株的VP1氨基酸序列与各基因型代表株的同源性均大于90%。此外，有研究表明近来在中国流行的Cox A16病毒很可能为包含有多种其他A型肠道病毒的重组病毒，重组位点大多发生在病毒基因组的P1区和P2区^[13,17]。湖州市的Cox A16分离株是否也是重组株有待进一步通过全基因组测序证实。

流行病学资料显示,Cox A16常常和EV71交替或共流行造成手足口病频繁暴发。在流行过程中，Cox A16感染比例往往超过EV71,并且Cox A16多以轻症患者为主,因此其在流行中所占实际比例可能更高。此外，同一时期的HFMD病例中可能还存其他不同基因型别的肠道病毒流行，易发生肠道病毒间的基因重组。因此应加强对Cox A16的分子流行病学研究，及时监测病毒的变异与重组情况，为中国Cox A16流行株的基因特征研究积累基础数据。