自2013年3月31日国家卫生和计划生育委员会首次公布3例人感染H7N9禽流感病例后，国内多个省市陆续报告了人感染H7N9禽流感病例。与以往报道的H7亚型禽流感病毒轻症感染病例不同，此次H7N9禽流感病毒感染者病情进展迅速，常 由重症肺炎进展为急性呼吸窘迫综合征、感染性休克、多器官功能障碍，甚至死亡^{[1, 2]}。由于目前该病毒感染的确诊主要依赖实验室诊断，因此结合临床，总结归纳现有病例的实验室诊断结果，对于病例的早发现、早诊断、早治疗，从而降低死亡率具有重要意义。2013年7月19日，北京市确认1例外地输入型人感染H7N9禽流感病例。该患者无慢性基础性疾病，自确诊首日起开始使用神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抑制剂，分别是奥司他韦1 d，剂量为2次/d，75 mg/次，而后使用帕拉米韦，累计服用18 d，剂量为1次/d，300 mg/次。经过25 d的住院抢救，患者病情一度出现稳定和好转，但最终因感染加重、多器官功能衰竭而死亡。该病例的病程进展具有代表性，本研究选择该病例不同时间点的系列样本，通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time,RT-PCR)对病毒载量进行了测定，对治疗过程中病毒是否对NA抑制剂类药物产生耐药进行监测，同时通过血凝抑制试验对患者血清特异性抗体效价进行了分析，为进一步开展H7N9禽流感病毒研究提供依据。

每日连续收集2013年7月报告的1例北京市输入型人感染H7N9禽流感确诊病例下呼吸道道盥洗液及血清样本，至病例死亡停止采集。共收集下呼吸道盥洗液样本25份，血清23份。所有样本采集后于4 ℃保存，低温运至实验室，12 h内开展检测。

使用QIAmp viral mini Kit试剂盒(德国QIAGEN公司产)提取280 μl样本中的总RNA，提取方法按试剂盒说明书进行，病毒RNA溶于60 μl DEPC水中，立即用于real-time RT-PCR检测。

利用real-time RT-PCR法，使用Ag-Path ID One-step RT-PCR kit(美国Life Technologies公司产)在ABI 7500荧光PCR仪上完成。甲型流感病毒基质蛋白(Influenza A Matrix protein，AM)基因的引物探针设计参考世界卫生组织(WHO)和国家流感中心下发方案文件^[3]，由上海生工公司合成；反应体系配制参照试剂盒说明书。反应程序为45 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共45个循环，60 ℃ 45 s阶段收集荧光信号。使用本室制备的AM基因定量标准品(10⁰～10⁶ copies/ml，7个浓度梯度)进行定值。样本中AM基因拷贝数由标准品拷贝数(copies/ml)-Ct值标准曲线获得，所有定量检测重复3次，取其平均值作为最终检测结果。

利用real-time RT-PCR法，使用Ag-Path ID One-step RT-PCR Kit(美国Life Technologies公司产)在ABI 7500荧光PCR仪上完成。同时检测H7N9禽流感病毒上NA抑制剂类药物敏感性标志基因，NA基因NA 294R位点及耐药性标志基因NA 294K位点，其特异性引物探针序列参考Hu等^[4]的设计，由上海生工公司合成；反应体系及反应程序见1.3。

利用血凝抑制试验，标准抗原采用灭活H7N9疫苗种子株NIBRG-268，由北京科兴生物制品有限公司提供，马血球购自北京京顺秀山养殖中心。检测步骤依照中华人民共和国卫生行业标准WS 285 2008流行性感冒诊断标准附录B进行。每份样本平行测定3次，取其平均值作为抗体滴度结果。

将病例下呼吸道盥洗液样本中H7N9病毒的AM基因的定量检测结果作为病毒载量，对病例病程中H7N9病毒载量变化进行统计分析，结果显示，在该病例确诊首日，即病程为6 d时，下呼吸道盥洗液中H7N9禽流感病毒载量最高，为5.25×10⁶ copies/ml，随后随病程进展，病毒载量不断下降，至病程24 d时下降为5.49 copies/ml。其中在病程的初期病毒载量下降速度最快，6 d内即从5.25×10⁶ copies/ml降至1.59×10³ copies/ml；在病程中期(12 ~19 d)，病毒载量一直维持在10³ copies/ml水平上下，下降速度缓慢；自病程第20～28 d期间，病毒载量在10¹~10² copies/ml的低水平上有所反复，至29 d后病毒载量降低为0。整个病程中病毒载量中位数为157.76 copies/ml，见图1。

图 1 病例病程中H7N9禽流感病毒载量的变化 Fig.1 Change of H7N9 viral load during illness

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针对所有下呼吸道盥洗液样本中NA抑制类药物耐药性突变标志基因294位点，使用real-time RT-PCR法分别对药物敏感性基因NA 294R基因与耐药性基因NA 294K基因进行检测，结果显示，所有监测样本的药物敏感性基因NA 294R编码基因均为阳性；病程22、23、28 d样本耐药性基因NA 294K基因呈弱阳性，其余样本NA 294K基因为阴性，表明在病程后期患者所感染的H7N9病毒中有少部分发生了耐药性突变，见图2。

图 2 NA 294位耐药突变检测结果 Fig.2 The results of the R294K mutation on the neuraminidase gene 注： *为阳性对照；**为阴性对照。

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对病程中采集的系列血清样本，检测其H7N9禽流感病毒特异性抗体的变化，结果显示，自病例病程为8 d起，抗H7N9病毒抗体开始逐步升高。在病程9~12 d期间，抗体滴度每日成倍增长，由10升至80，为抗体滴度增长速度最快时期。至病程达16 d后，抗体滴度达到平台期，稳定在640，直至病程达27 d时，抗体滴度升高至最高点，滴度为1280，持续3 d后，抗体滴度略有下降，但仍维持在较高水平，见图3。

图 3 病例病程中抗H7N9病毒抗体血凝抑制滴度的变化 Fig.3 Titers of anti-H7N9 virus antibody during illness

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H7N9禽流感病毒作为一种新发的可感染人甲型流感病毒，其内部基因来源已被多项研究所揭示。该病毒可能为三重重配病毒，即病毒的节段4血凝素基因(HA)来源于A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)病毒，节段6 NA基因来源于A/wild bird/Korea/A14/2011(H7N9)病毒，其余6个节段则来源于以A/brambling/Beijing/16/2012(H9N2)病毒为代表的4种不同禽源病毒^[5]。WHO和国家流感中心推荐以节段4的HA基因和节段6的NA基因为H7N9特异性扩增靶标进行real-time RT-PCR PCR检测确定H7N9禽流感病毒感染，本研究中，在通过上述H7和N9基因检测确诊感染后，使用甲型流感病毒基质基因AM基因作为靶标进行real-time RT-PCR检测，同时结合患者临床表现，探讨随病程进展患者下呼吸道样本中病毒载量的变化。患者患病首日仅出现咳嗽、发热等症状，体温38 ℃，发病4 d后进展为重症肺炎，6 d时进展为急性呼吸窘迫综合征、呼吸困难，其后虽有好转但终在病程进展到32 d时因急性肾功能衰竭、感染中毒性休克死亡。本研究中因未收集到病例发病首日至发病5 d期间的样本，无此期间病毒载量变化结果，但本研究结果表明，随着病程进展及临床救治，病毒载量在患者病情迅速进展的第6天达到最高，此时开始使用流感病毒神经氨酸酶抑制剂类药物，病毒载量呈逐步下降趋势。在患者发病2周内，病毒载量下降速度最快，表明在临床救治中在病程早期的治疗效果最为显著。患者血清抗体检测结果则表明病例自确诊7 d起即出现了明显的免疫应答，随着病程持续，抗体滴度不断增加，至16 d达到平台期并保持在较高水平。此结果提示患者对该病毒应答良好，同时结合患者病毒载量变化情况，结果显示在患者发病1周后血清特异性抗H7N9抗体逐步升高的同时，其呼吸道内病毒载量也明显下降，至2周后抗体水平达到峰值时，病毒载量下降速度也呈现为在较低水平上缓慢下降，且直至发病4周时仍可检出病毒。本研究中患者一直在重症监护室，本结果是否提示当患者症状较重时，患者体内即使产生较高水平抗体，并有效抑制了病毒复制，但仍有少量病毒难以清除，仍需进一步研究核实。

目前已有研究经证实，H7N9流感病毒NA 294位基因精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)与奥司他韦等NA抑制剂类药物的临床耐药密切相关^[6]。同时由于当前人感染H7N9病毒的M2蛋白存在S31N位点突变，导致对金刚烷胺类药物普遍耐药，因此NA抑制剂对H7N9禽流感感染的治疗变得尤为重要^[7]。Wu等^[8]的研究显示，A/Shanghai/1/2013(H7N9)毒株NA蛋白存在R294K突变。该突变位点位于NA蛋白单体表面，可导致N2和N9亚型病毒对NA抑制剂的敏感性，从而出现耐药。但该耐药位点并没有在A/Anhui/1/2013(H7N9)等其他H7N9毒株中出现。在本研究病例中，在病程3周内样本中，NA294位点为均为仅有294K药物敏感性阳性，未发现R294K的耐药突变，提示病毒对奥司他韦等NA抑制剂敏感。但在病程后期的22、23和28 d样本中，NA294位点R基因检测阳性同时NA294位点K基因检测弱阳性。将RNase P基因作为对照基因，使用2^-ΔΔCt公式进行初步推算，在病程22、23和28 d样本中分别有约0.19%、0.10%和0.39%的病毒出现NA294位点K基因变异。这一结果提示经持续的抗病毒治疗后可能有少量病毒出现NA抑制剂耐药突变，但优势病毒亚群对NA抑制剂依然敏感。

本研究中对病例血清抗体的检测使用了经典的血凝抑制试验^{[9, 10]}。该方法所检测到的患者血清特异性抗体水平，既能用于患者免疫应答水平的评估，也可反映患者感染病毒的抗原性。对于病例对感染病毒的应答，使用自病例样本中分离到的病毒最好，但因受生物安全实验室级别所限，本实验室无H7N9病毒分离条件，因此本研究中抗体检测使用抗原为H7N9疫苗种子株NIBRG-268，而非患者自身感染病毒，这对H7N9抗体检测所造成的影响，尚待进一步证实。但本实验室同时使用该疫苗株对健康人群及禽类养殖人员，共计3000人份血清样本进行了检测，结果显示，H7N9抗体滴度均 < 5，而对另外2例H7N9确诊病例的血清抗体滴度均 > 40，表明该抗原可有效反映患者对H7N9病毒的感染情况及抗体应答情况。

综上所述，本研究通过对H7N9禽流感感染病例样本的real-time RT-PCR 检测验证了奥司他韦等NA抑制剂药物的临床疗效，同时提示实时荧光定量RT-PCR具有用于治疗监测的可能，可为人感染H7N9禽流感病毒重症患者的抗病毒治疗提供参考依据。同时本研究分析了患者血清特异性抗体水平，显示目前发现的人感染H7N9禽流感病毒株高抗原性保守，可激发人体产生有效的免疫应答。本研究针对单个病例的连续样本进行分析，研究结果不仅有利于病毒核酸扩增分 型检测和血清学检测的开展，避免因病毒变异出现假阴性结果；同时便于开展基因、蛋白溯源和分子遗传学研究，为探明病毒起源和开展疫情防控奠定基础。