疾病监测  2014, Vol. 29 Issue (9): 684-687

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张眉眉, 于伟, 孙海波, 王璐璐, 姚文清
ZHANG Mei-mei, YU Wei, SUN Hai-bo, WANG Lu-lu, YAO Wen-qing
辽宁省首株人腺病毒14型的分离与鉴定
First isolation and identification of human adenovirus type 14 in Liaoning
疾病监测, 2014, 29(9): 684-687
Disease Surveillance, 2014, 29(9): 684-687
10.3784/j.issn.1003-9961.2014.09.004

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收稿日期：2014-2-13
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张眉眉, 于伟, 孙海波, 王璐璐, 姚文清. 辽宁省首株人腺病毒14型的分离与鉴定[J]. 疾病监测, 2014, 29(9): 684-687.
ZHANG Mei-mei, YU Wei, SUN Hai-bo, WANG Lu-lu, YAO Wen-qing. First isolation and identification of human adenovirus type 14 in Liaoning[J]. Disease Surveillance, 2014, 29(9): 684-687.
辽宁省首株人腺病毒14型的分离与鉴定
张眉眉, 于伟, 孙海波, 王璐璐, 姚文清    
辽宁省疾病预防控制中心感染与传染病所, 辽宁 沈阳 110005
收稿日期:2014-2-13
基金项目：国家重大传染病防治科技重大专项（No.2012ZX10004209-001）.
作者简介: 张眉眉，女，辽宁省沈阳市人，副主任技师，本科，主要从事病原微生物研究工作
通讯作者：姚文清，024-23388316，Email：wenqingyao@sina.com
摘要：目的 研究从急性呼吸道感染（acute respiratory disease，ARD）患者咽拭样本中分离到的1株人腺病毒的基因型别。 方法 从辽宁省沈阳市采集ARD患者咽拭样本，用细胞培养方法分离病毒，对引起HEP-2细胞病变（CPE）的病毒用人腺病毒属通用引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测，并对阳性PCR产物进行测序分析；对病毒六邻体基因（HEXON）进行测序并与GenBank中其他人腺病毒参考毒株序列进行比较；用Mega 3.1软件、以邻位相连法构建人腺病毒属HEXON基因遗传进化树。 结果 从辽宁省沈阳市ARD患者咽拭样本中分离到1株病毒，人腺病毒属通用引物PCR检测阳性，阳性PCR产物测序结果与人腺病毒14型参考毒株序列完全一致；该腺病毒HEXON基因测序全长2838 bp，负责编码946个氨基酸，亦与人腺病毒14型参考毒株序列有100%的一致性；HEXON基因遗传进化树分析显示该腺病毒与人腺病毒14型参考毒株在系统发生树上处在同一进化分支上。 结论 辽宁省沈阳市ARD患者咽拭中分离到的腺病毒为人腺病毒14型，GenBank收录号为KC825052。
关键词： 人腺病毒14型     分离与鉴定     进化树    
First isolation and identification of human adenovirus type 14 in Liaoning
ZHANG Mei-mei, YU Wei, SUN Hai-bo, WANG Lu-lu, YAO Wen-qing     
Liaoning Provincial Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 110005, Liaoning, China
Abstract:Objective To understand the genotype of 1 human adenovirus strain isolated from throat swab of a patient with acute respiratory disease. Methods The throat swabs were collected from ARD patients in Shenyang, Liaoning province and viruses were isolated by cell culture. The isolated virus causing cytopathogenic effect (CPE) on HEP-2 cells was tested by using polymerase chain reaction (PCR) with universal human adenovirus primers and the positive. PCR-product were sequenced and analyzed. The complete genome of Hexon were sequenced and compared with sequences of the other human adenovirus from GenBank. The phylogenetic tree of the complete genome of Hexon gene was constructed by using neighbor-joining method with software Mega 3.1. Results One adenovirus strain was isolated form a patient with ADR and the PCR result was positive. The sequence of amplifying segment was the same as human adenovirus type 14 reference strain. The entire genome of hexon was 2838 nucleotides long and was predicted to encode 946 amino acids, which shared 100% homology with human adenovirus type 14 reference strain. Phylogenetic analysis of the complete genome of Hexon showed the isolate and human adenovirus type 14 reference strain all belonged to one branch in the phylogenetic tree. Conclusion The strain isolated from the throat swab of a ARD patient in Shenyang was human adenovirus type 14 (GenBank accession number: KC825052).
Key words: Human adenovirus type 14     Isolation and identification     Phylogenetic tree    

腺病毒属于DNA病毒，无包膜，基因组相对较大，大约36 kb。目前发现57个血清型，分别属于A~G 7个组。人腺病毒引起呼吸道和结膜炎感染最为常见，尤其是3、7和14型引起的社区和军队内的暴发流行时有报道[1, 2, 3, 4]。2008年9月，在辽宁省流感网络监测中，从1名急性呼吸道感染(acute respiratory disease，ARD)患者咽拭样本中分离到1株人腺病毒，经过腺病毒 六邻体基因(HEXON)全基因测序和遗传进化树分析，证明该腺病毒为人腺病毒14型。现将鉴定结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞及试剂

HEP-2细胞(本实验室保存)；DNA提取试剂盒和聚合酶链反应(colymerase chain reaction，PCR)回收试剂盒(美国Qiagen公司)；PCR产物克隆用载体pMD19-T、JM109感受态细胞、RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；其他试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 人腺病毒属参考毒株

所用人腺病毒全基因序列全部来自GenBank，分别为HAdV-1 AC_000017，HAdV-2 AC_000007，HAdV-3 DQ086466，HAdV-4 NC_003266，HAdV-4 NC_003266，HAdV-5 AC_000008，HAdV-6 HQ413315，HAdV-7 AC_000018，HAdV-8 AB746853，HAdV-11 NC_011202，HAdV-12 NC_001460，HAdV-14p (AY803294)，HAdV-14 JX892927，HAdV-16 JN860680，HAdV-18 GU191019，HAdV-19 JQ326209，HAdV-21 AY601633，HAdV-31 AM749299，HAdV-32 JN226756，HAdV-34 AY737797，HAdV-35，AC_000019，HAdV-37 AB448778，HAdV-40 NC_001454，HAdV-41 DQ315364，HAdV-50 AY737798，HAdV-52 DQ923122，HAdV-55 FJ643676，HAdV-56 HM770721，HAdV-57 HQ003817。 1.1.3 引物

人腺病毒属通用引物Adhex-GT3和FAdhex-GT2R参照文献[5]合成，理论扩增片段长度842 bp，扩增区域包含部分HEXON基因。HEXON全基因测序所用另外2对引物通过用Primer Premier 5.0 软件自行设计，所用引物详见表 1，均由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行引物合成。 1.2 方法 1.2.1 样本处理及病毒分离

将咽拭液4 ℃，12 000 r/min离心20 min。取0.1 ml上清液接种HEP-2细胞，置35 ℃、5%CO2培养箱，1 h后弃去接种液体，加入7 ml细胞维持液(血清含量为2%)，细胞置于35℃、5% CO2培养箱中继续培养，逐日观察细胞病变；在HEP-2细胞中连续盲传3代，弃去无病变者，将发生病变者连续传代，使之出现规律病变。按DNA提取试剂盒操作说明，从病变细胞维持液中提取病毒DNA；提取纯化后的DNA保存在-80 ℃冰箱中备用。 1.2.2 PCR检测及序列分析

以提取的病毒DNA为模板进行PCR分析。使用多种呼吸道病毒通用引物进行检测，并进行分析。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR结束后，扩增的特异性片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。经检测，人腺病毒扩增条带清晰无杂带，检测结果为阳性。以扩增获得预计大小的片段为阳性判定标准；阳性PCR 产物采用回收试剂盒回收后，与质粒pMDl9-T载体连接，然后转化大肠埃希菌JM109感受态细胞，通过蓝白斑筛选与菌落PCR鉴定，阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果在NCBI GenBank中用Blastn进行比较分析。 1.2.3 病毒HEXON全基因克隆、测序及进化树分析

以提取的病毒DNA为模板，分别用ADBF2、ADBR2和ADBF3、ADBR3两对引物进行PCR反应，PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。阳性扩增产物用胶回收试剂盒回收后，与质粒pMDl9-T载体连接，然后转化大肠埃希菌JM109感受态细胞，通过蓝白斑筛选与菌落PCR鉴定，阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。测序结果在GenBank中用Blastn进行比较分析，经Seqman软件拼接后获得病毒HEXON全基因核苷酸碱基序列，用DNAstar软件对全基因序列进行分析；采用Mega 3.1软件邻位相连法(Neighbor-joining) 以41人腺病毒为外群(outgroup)，构建人腺病毒属编码区全基因遗传进化树，步长值设为1000。

表 1 本研究腺病毒扩增所用引物 Table 1 Primer sequences for amplification of HAdV used in this study
引物方向核酸起始位点 序列(5′~3′)
Adhex-GT3FSense18 4375′-CSG GNC AGG AYG CYT CGG RGT A-3′
Adhex-GT2RAnti-sense19 2785′-CAC CCA TGT TRC CWG TNC TGT T-3′
ADBF2Sense19 202 5′ -CAA CAG ACC CAA CTA CAT TGG CTT CAG-3′
ADBR2 Anti-sense20 420 5′ -GCT CAC TGA AGA GTC AAA CAT GAT GGA-3′
ADBF3Sense20 221 5′ -CCA TTT CCA TTC CTT CTC GCA ACT G-3′
ADBR3Anti-sense21 414 5′ -GAC CCT CAT ATT CAA ACT GGT AAA TCT GT-3′
表选项
2 结果 2.1 感染细胞病变及病毒分离

咽拭液接种HEP-2细胞后，有1瓶接种细胞于48 h左右出现细胞病变，病变开始表现为细胞变形变圆，排列紊乱，细胞成拉网状；72 h左右病变达到高峰，表现为细胞圆缩、聚集和脱落，见图 1。

图 1 感染和未感染HEP-2细胞(×100) Figuer 1 Uninfected HEP-2 cells and infected HEP-2 cells (100×magnification)
图选项
2.2 分离株PCR检测及序列分析

从病变细胞中提取病毒DNA，用人腺病毒通用引物进行PCR扩增。扩增条带经琼脂糖凝胶电泳显示，片段大小在900 bp左右，见图 2，条带清晰无杂带。PCR扩增片段经TA克隆并进行测序，由测序结果可知该片段扩增长度为842 bp。将病毒序列在GenBank中用Blastn进行比对分析，发现与序列号为JQ824845的2010年广东14型人腺病毒毒株和序列号为JN032132 的2010年北京14型人腺病毒毒株的同源性高达100%，因此将该株病毒鉴定为人腺病毒14型。

图 2 PCR产物琼脂糖电泳 Figuer 2 PCR products on agarose gel 注：M. Marker DL2000； S.标本条带； —.阴性对照。
图选项
2.3 人腺病毒HEXON全基因和进化树分析

将测序结果拼接获得HEXON全基因碱基序列并用DNAstar软件对病毒全基因序列进行分析。该病毒基因全长2838 bp，负责编码946个氨基酸。亦与人腺病毒14型参考毒株序列有100%的一致性；HEXON基因遗传进化树分析(图 3)显示该腺病毒与人腺病毒14型参考毒株在系统发生树上处在同一进化分支上。

图 3 HEXON全基因种系发生树 Figuer 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of complete Hexon
图选项
2.4 GenBank收录

根据上述结果，本次在辽宁省沈阳市分离到的病毒株为人腺病毒14型，将此序列上传至NCBI GenBank中，获得收录号为KC825052。 3 讨论

人腺病毒首次发现于1953年[6]。人腺病毒能引起人类广泛的疾病：急性上、下呼吸道感染，爆发性眼结膜炎，急性出血性膀胱炎及婴幼儿胃肠炎等[7]。2006年5月美国纽约市一名出生12天的女婴患人腺病毒14型引起的上呼吸道感染;2007年 3 6月在俄勒冈、华盛顿和德克萨斯州有140例患者感染人腺病毒14型，导致9人死亡，研究结果显示为人腺病毒14型变异株导致[8]。近年来的研究发现，HAdV开始出现越来越多的变异，特别是主要中和性抗原六邻体蛋白，新近发现的几株新亚型均为六邻体基因的变异重组株[9]。我国陕西省2006年暴发的人腺病毒感染经基因组测序鉴定为HAdV-14和AdV-11六邻体基因的重组体，并命名为新型HAdV-55。新出现的变异株及新亚型其传染性可能更强，人群尚未形成免疫保护。因此，今后对我国目前流行的人腺病毒六邻体蛋白基因的变异情况进行实时监测至关重要，有助于预测人腺病毒可能引起的爆发性疾病，为疾病防控提供参考依据。本研究从临床流感样病例咽拭子标本中分离出病毒，用人腺病毒属通用引物进行PCR检测，并对阳性PCR产物进行测序分析，测序结果与2010年广东14型人腺病毒毒株[10]和2010年北京14型人腺病毒毒株[11, 12]的序列完全一致，同源性高达100%。对病毒HEXON基因进行测序获得完整的全长基因序列，提交到GenBank，并与GenBank中其他人腺病毒参考毒株序列进行比较，确定该序列与HADV-14六邻体基因序列同源性最高位100%，从而证明该株病毒为人腺病毒14型。

参考文献
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