脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)是引起流行性脑脊髓膜炎(流脑)的病原菌，也是细菌性脑膜炎的主要病原菌之一^[1]。根据荚膜多糖的结构，脑膜炎奈瑟菌分为A、B、C、X、Y、Z、E、W、L、H、I和K共12个血清群。另有一些菌株不能归为以上血清群，称为不可分群菌株(non-serogroupable，NG)^[2]。能引起侵袭性流脑病例的菌株多具有完整的荚膜，主要包括A、B、C、W、Y和X 6个血清群^{[3, 4]}。

一直以来，NG菌株在健康人群中携带率较高，被认为没有致病性或仅在免疫低下的人群中引起感染^[5]。但是，由NG菌株致病的情况也屡见报道^{[6, 7]}，2010年，我国也发现了首例由NG菌株感染引起的脑膜炎病例^[8]。

本研究采用普通聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR)方法，对我国2005 2011年分离的104株NG脑膜炎奈瑟菌菌株进行了基因分群，并运用多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)方法，对这些菌株进行了分子分型分析。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

104株NG脑膜炎奈瑟菌分离自我国17个省(直辖市)的健康带菌者，分离时间为2005 2011年；其中1株分离自北京2009年脑膜炎患者脑脊液。 1.1.2 主要仪器、试剂

PCR仪为Bio-Rad DNAEngine，凝胶成像仪为Gel Doc XR，均为Bio-Rad公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPs及100 bp DNA Marker购于TaKaRa生物工程公司。DNA提取采用Promega Wizard基因组DNA纯化试剂盒。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 菌株鉴定和DNA提取

所有脑膜炎奈瑟菌经涂片革兰染色、API NH(法国生物梅里埃公司)生化鉴定和血清学玻片凝集检测(美国Remel公司分群血清)，证实为NG脑膜炎奈瑟菌。收集哥伦比亚巧克力平板上新鲜培养的菌苔，用Promega试剂盒提取染色体DNA。 1.2.2 基因分群PCR

用于A、B、C、W、Y、E、X、Z、H、I、L、K基因群鉴定的PCR方法参照文献 ，荚膜基因缺失菌株(capsule null locus，cnl)的鉴定采用一对覆盖整个荚膜基因A区和C区的引物(位于荚膜基因C区上游的tex和A区下游的galE基因中)^{[12, 13]}。所有引物序列见表 1。质控阳性菌株号分别为A(CMCC29019)、B(CMCC 29021)、C(CMCC 371101)、E(CMCC 29034)、W(CMCC 29037)、Y(CMCC 29028)、H(CMCC 29031)、I(CMCC 29044)、K(CMCC 29046)、Z(ATCC35562)、L(ATCC43828)和X(CMCC 29040)。

MLST是通过测定7个管家基因的核苷酸序列来发现细菌变异的分型方法。使用普通PCR方法扩增7个等位基因并测定其序列，方法参照文献^[14]。PCR产物由天一辉远基因公司测序。测序结果递交MLST网上数据库进行比对，获得等位基因序列号、ST型和序列群。用Excel软件进行数据的整理分析。 1.2.4 菌株进化关系分析

采用BioNumerics构建多位点序列分型的最小生成树，分析菌株基因群结构和遗传进化关系。 2 结果 2.1 基因群分布

通过基因分群PCR鉴定，104株NG菌株中，36株为cnl菌株(34.6%)，20株为B群(19.2%)，14株为C群(13.4%)，9株为W群(8.6%)，9株为E群(8.6%)，3株为X群(2.9%)，3株为Y群(2.9%)(表 2)。10株菌株没有鉴定出基因群(所有分群引物扩增结果均为阴性)，未发现其他基因群的菌株。

104株NG菌株共分为45种ST型，包括14种新的ST型，其中17个ST型可归为7个序列群(65株)，ST-198序列群以ST-2146型为主(25株)，C群的ST-4821序列群以ST-4821型为主(5株)。总体而言，数量最多的序列群为ST-198序列群，数量其次的为ST-4821序列群(图 1)。由图 1可以看出cnl菌株均属于ST-198序列群。ST-4821序列群涵盖B、C基因群和基因未分群，除ST-4821序列群外，已定义的同一序列群菌株都属于相同的基因群(不包括未分群)。反之，同一基因群的菌株可以包括不同的序列群。B群包括ST-4821和ST41/44两种序列群；C群包括ST-4821序列群；W 群包括ST-11和ST-174两种ST序列群；Y群包括ST-175和ST-92序列群；E群和X群的菌株都未能归入已定义的ST序列群。10株未能鉴定出基因群的菌株中，5株属于ST-4821和 ST-175序列群，另外5株未能归入已定义的ST序列群。

图 1 中国NG脑膜炎奈瑟菌多位点序列分型最小生成树 Figure 1 Minimum spanning tree of sequence type of 104 NG N.meningitidis strains 注：图中每个圈代表一种ST型，圈的大小代表菌株数量的多少，不同的颜色代表不同的基因群。

图选项

NG脑膜炎奈瑟菌株多为健康人群携带，较少致病。NG脑膜炎奈瑟菌形成的机制有3种，对于B、C、Y基因群，siaD基因滑链错配或者点突变使其终止密码子提前出现，从而使荚膜的生物合成和转运障碍，导致荚膜的缺失；其次IS元件的插入也可导致荚膜基因的不表达；第三种机制为荚膜基因A区和C区缺失所形成的cnl菌株^[12]。前两种情况形成的菌株仍然可以用PCR进行基因分群。

本次研究对来自全国不同地区共104株NG脑膜炎奈瑟菌进行了基因群鉴定和MLST分型。基因群鉴定结果显示，我国NG脑膜炎奈瑟菌基因群主要为B、C、W、E，这与我国健康人群鼻咽部分离的可分群菌株的血清群一致^{[15, 16]}。值得注意的是A群菌株，早期的研究结果显示，欧洲NG脑膜炎奈瑟菌中未发现A基因群菌株，但因为血清可分群的A群脑膜炎奈瑟菌在该地区非常少见，所以并未引起研究者的关注^[12]。在我国，A群是目前我国主要流行菌群之一，而且在中西部还是优势菌群^[16]，然而本研究中我们也未发现基因群为A的菌株，提示A群菌株在荚膜基因的稳定性上不同于其他血清群。

我国血清可分群B群和C群的脑膜炎奈瑟菌的流行都以ST-4821序列群为主^[17]，本研究中的B群与C群的ST序列群均包括ST-4821序列群，基因群为W的NG脑膜炎奈瑟菌主要的ST序列群为ST-11和ST-174，并以ST-174序列群为主，ST-174和ST-11也是可分群W的主要序列群^{[15, 18]}。这一结果说明我国NG脑膜炎奈瑟菌株与可分群脑膜炎奈瑟菌株的主要ST群一致。

本研究中，cnl菌株的MLST分型全部为ST-198序列群，而所有ST-198序列群也都是cnl菌株。cnl菌株缺少荚膜基因A区和C区，作者认为cnl菌株已不表达荚膜。由MLST数据库检索可知，国外cnl菌株并不全属于ST-198序列群，如第1株全基因组测序的cnl菌株(α14)属于ST-53序列群；国外ST-198序列群菌株也涵盖B、W、E、X等多个血清群。这一结果提示中国的ST-198序列群的cnl菌株在进化上可能属于一个独立的分支，这也是我国第一次对cnl菌株进行分析。

脑膜炎奈瑟菌的荚膜是脑膜炎奈瑟菌的主要毒力因子之一，可以抵御宿主补体介导的溶菌作用及单核巨噬细胞调理吞噬作用。然而，荚膜也是宿主黏膜免疫的靶成分，因此荚膜缺失反而有利于菌株的定植和侵袭^{[19, 20]}。近几年的NG致病病例在全球范围内都有发生，提示我们需要对中国NG脑膜炎奈瑟菌的研究应引起重视。同时，NG脑膜炎奈瑟菌在人群中携带而又极少致病，提示其在维持机体内微生态系统平衡中是否起到一定的作用。本研究结果也显示，NG菌株与血清可分群菌株之间存在紧密的关系，因此，研究NG菌株也是阐释可分群菌株致病及流行特征的另一种角度和途径。