宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤。研究表明，高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持续感染与子宫颈癌发病密切相关。目前，HPV核酸检测已成为宫颈癌及癌前病变一种重要的筛查手段^[1]。HPV已鉴定出100多种型别，根据其致病性大小，分为低危型和高危型两大类，其基因型分布具有地域性特征^{[2, 3, 4, 5]}。笔者拟采用流式荧光杂交法检测舟山海岛地区女性宫颈炎患者HPV感染情况及型别分布，为本地区开展预防控制提供基础数据。 1 对象与方法 1.1 对象

2012年8月至2014年2月舟山医院经阴道镜活检筛查出的女性宫颈炎患者。排除无性生活史、妊娠期、月经期、24 h内有性生活及3天内有阴道上药或阴道冲洗者。观察对象均已签署知情同意书。 1.2 仪器与试剂

多功能流式液相芯片分析仪(Luminex200)；PCR仪(RIO-RAD MyCycler 580BR USA)；离心机(eppendorf centrifuge 5417R)；金属浴(CHB-100，杭州大和热磁电子有限公司)；HPV分型检测试剂盒(YBZ/国0336-2013，上海透景生命科技有限公司)。 1.3 方法 1.3.1 样本采集

医护人员以扩阴器暴露宫颈口，用棉拭子将宫颈口的分泌物擦去。将宫颈刷伸入宫颈口处，紧贴宫颈口顺时针轻柔转动4~5周。慢慢抽出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的洗脱管中。在管口处沿刷柄折痕将宫颈刷折断，宫颈刷头留在洗脱管中。旋紧管盖，做好样本标识，并保持洗脱管直立放置。 1.3.2 HPV分型检测

流式荧光杂交法(flexible multi.analyte profiling，xMAP)采用多重聚合酶链反应(PCR)技术对检测样品的核酸DNA进行扩增，并用包被有核酸探针的多种编码微球和扩增产物进行杂交，结果用Luminex多功能流式点阵仪检测分析。 1.3.2.1 DNA提取

振荡混匀取样本200 μl，14 000 r/min离心3 min。吸弃上清，加入200 μl的脱落细胞核酸释放剂，振荡混匀，放入100 ℃金属浴中保温15 min。再14 000 r/min离心5 min。取上清液待用。 1.3.2.2 PCR扩增

取5 μl提取的DNA作为模板，用上海透景生命科技有限公司提供的试剂盒配制PCR反应体系在PCR扩增仪中进行扩增，热循环条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(5个循环)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35个循环)； 72 ℃ 3 min。 1.3.2.3 杂交检测

将3 μl PCR扩增产物和22 μl 微球杂交液进行混合，并经过95 ℃ 5 min变性，48 ℃ 30 min杂交后，加入75 μl SA-PE荧光素标记48 ℃孵育15 min，迅速移至Luminex多功能流式点阵仪检测分析。所有操作步骤严格按照上海透景生命科技有限公司提供的试剂盒说明书进行。 1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计算HPV的感染率，使用χ²检验进行比较。 2 结果 2.1 舟山海岛地区妇女HPV检出率及HPV

基因型分布 共对997例女性宫颈炎患者进行HPV检测，检出HPV 阳性者220例，检出率22.1%(220/997)。检出18种HPV基因型，高危型HPV、低危型HPV和多重HPV检出率分别为13.8%(138/997)、0.4%(4/997)和7.8%(78/997)，见表 1。

220例HPV感染者中，单一HPV感染142例，占14.2%(142/997)，二重以上HPV 感染78例，占7.8%(78/997)。多重HPV感染者中，二重HPV感染59例，占5.9%(59/997)，三重HPV感染19例，占1.9%(19/997)，高危型和低危型混合感染24例，占2.4%(24/997)。 2.3 不同年龄人群中HPV感染情况

997例受检者年龄20～72岁，平均(40±12)岁，将其分为20~ 岁、31~ 岁、41~ 岁、51~ 岁、>60岁5个年龄组，不 同年龄人群中HPV多重感染状况见表 2。不同年龄组人群HPV 阳性检出率差异有统计学意义χ²=58.7(P<0.05)，其中31～岁年龄组HPV 检出率最高，为8.1%(81/997)。不同年龄人群单一亚型HPV感染者中高危型和低危型的感染情况见表 3。

本研究运用流式荧光杂交技术检测HPV分型。流式荧光杂交技术是一种液相生物芯片技术，它与其他传统的HPV分型检测方法比较，具有明显的优势，该方法具有操作简便、高通量(一次性96个样本检测)、高灵敏度(低至10拷贝)、重复性好和特异性强等优点，是如今国内检测HPV分型的较理想方法之一。本研究基于Luminex平台，检测流程快捷，结果客观可靠，优势明显。且针对HPV感染的型别地域流行性差异，还可自由选择HPV某几种型别进行检测，灵活性好。

本研究结果显示，HPV分型检测共检测出19种亚型，HPV 11型等未检出，可能因样本量不够及地区差异等因素造成。排在前5位的高危型HPV检出率依次为HPV 52型、58型、16型、18型和33型；低危型HPV感染最高的亚型是HPV 6型。以上主要亚型检出率与裘轶超^[6]报道的绍兴地区HPV亚型分布前5位为HPV 16、52、58、cp8304、33略有差异^{[7, 8, 9, 10]}，可能与地区差异有关。但也有文献报道HPV 52和HPV 58在一些地区具有较高的检出率^{[11, 12, 13]}。在本研究中单一HPV感染者142例，二重以上HPV 感染者78例。HPV 52/58双重感染是检出频率最高的类型。目前，HPV多重感染与宫颈病变关系的研究较少^{[14, 15]}，本研究中HPV多重感染呈年轻化趋势，有待进一步验证。本研究对本地区女性人群HPV感染者不同年龄分布进行分析，高危型HPV 亚型感染在31～40岁为高峰期，随着年龄的增加，检出率降低。而低危型HPV 亚型感染在20~30岁较集中。与张燕等^[16]报道的老年HPV感染率有回升趋势，感染率随着年龄增长呈“U”形分布有差异，可能与本研究中老年妇女纳入研究的例数较少有关。可见，年龄是HPV感染的一个重要因素。年轻妇女HPV检出率高可能与性生活及性卫生具有密切的关系。

舟山海岛地区女性HPV 52和HPV 58亚型具有较高的人群检出率。单一感染以高危亚型感染为主，混合感染以两重亚型感染为主，31～40岁HPV检出率最高，主要HPV亚型可能与致病性相关。