疾病监测  2014, Vol. 29 Issue (9): 733-736

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杨杜鹃, 张海林, 苏梅惠, 王勇, 程雪琴, 杨卫红, 章域震, 冯云, 覃谊, 石山梅, 殷小栎, 张丽娟
YANG Du-juan, ZHANG Hai-lin, SU Mei-hui, WANG Yong, CHENG Xue-qin, YANG Wei-hong, ZHANG Yu-zhen, FENG Yun, QIN Yi, SHI Shan-mei, YIN Xiao-li, ZHANG Li-juan
血清学和分子生物学证实云南省勐海县存在恙虫病流行
Serological and molecular biological confirmation of transmission of scrub typhus in Menghai, Yunnan
疾病监测, 2014, 29(9): 733-736
Disease Surveillance, 2014, 29(9): 733-736
10.3784/j.issn.1003-9961.2014.09.016

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收稿日期：2014-3-13
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杨杜鹃, 张海林, 苏梅惠, 王勇, 程雪琴, 杨卫红, 章域震, 冯云, 覃谊, 石山梅, 殷小栎, 张丽娟. 血清学和分子生物学证实云南省勐海县存在恙虫病流行[J]. 疾病监测, 2014, 29(9): 733-736.
YANG Du-juan, ZHANG Hai-lin, SU Mei-hui, WANG Yong, CHENG Xue-qin, YANG Wei-hong, ZHANG Yu-zhen, FENG Yun, QIN Yi, SHI Shan-mei, YIN Xiao-li, ZHANG Li-juan. Serological and molecular biological confirmation of transmission of scrub typhus in Menghai, Yunnan[J]. Disease Surveillance, 2014, 29(9): 733-736.
血清学和分子生物学证实云南省勐海县存在恙虫病流行
杨杜鹃1, 张海林1, 苏梅惠2, 王勇3,4, 程雪琴3, 杨卫红1, 章域震1, 冯云1, 覃谊2, 石山梅2, 殷小栎2, 张丽娟3    
1. 云南省地方病防治所/云南省病毒立克次体研究中心, 云南 大理 671000;
2. 勐海县疾病预防控制中心, 云南 勐海 666200;
3. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 102206;
4. 新疆石河子大学动物科技学院, 新疆 石河子 832000
收稿日期:2014-3-13
基金项目：国家基础研究项目-973计划（No.2010CB530206）；国家“十二五”科技重大专项（No.2008ZX10004-008，2012ZX10004215）.
作者简介: 杨杜鹃，女，山西省壶关县人，医师，硕士，主要从事疾病预防控制工作
通讯作者：张丽娟，Tel：010-58900780，Email：zhanglijuan@icdc.cn；张海林，Tel：0872-2196147，Email：zhangHL715@163.com
摘要：目的 了解云南省勐海县恙虫病流行状况。 方法 2011年6-9月，在勐海县采集恙虫病临床诊断和疑似病例急性期和恢复期血液标本，用巢式聚合酶链反应（nPCR）对患者凝血块进行恙虫病东方体（Ot）热休克蛋白（groEL）基因扩增和测序分析。用间接免疫荧光试验（IFA）检测患者血清中Ot-IgG抗体。 结果 36例急性期患者凝血块标本经聚合酶链反应扩增，Ot核酸阳性25份，其中14份阳性标本被克隆和测序。同源性和进化分析显示，勐海县14株Ot的groEL区核苷酸同源性为99%~100%，氨基酸同源性均为100%，它们与来自GenBank的BJ-TZ-OT-O39、AH-GD-OT-S6、UT213、Kato和SH205株之间具有较高的同源性和较近的亲缘关系。17例病例双份血清经IFA检测，其中11例病例的恢复期血清IgG抗体滴度大于急性期血清4倍及以上。根据检测结果，26例病例被诊断为恙虫病（分子诊断15例和血清学诊断11例）。 结论 首次经血清学及分子生物学证实勐海县存在恙虫病流行。分子流行病学分析表明，勐海县Ot流行株具有稳定的遗传特点和明显的地域特征。
关键词： 恙虫病     监测     实验室诊断     巢式聚合酶链反应     间接免疫荧光试验    
Serological and molecular biological confirmation of transmission of scrub typhus in Menghai, Yunnan
YANG Du-juan1, ZHANG Hai-lin1, SU Mei-hui2, WANG Yong3,4, CHENG Xue-qin3, YANG Wei-hong1, ZHANG Yu-zhen1, FENG Yun1, QIN Yi2, SHI Shan-mei2, YIN Xiao-li2, ZHANG Li-juan3     
1. Yunnan Provincial Institute of Endemic Diseases Control and Prevention/Yunnan Provincial Center of Virus and Rickettsia Research, Dali 671000, Yunnan, China;
2. Menghai County Center for Disease Control and Prevention, Menghai 666200, Yunnan, China;
3. National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Changping, Beijing 102206, China;
4. College of Animal Science Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang, China
Abstract:Objective To understand the transmission of scrub typhus in Menghai county, Yunnan province. Methods Blood samples were collected from clinical diagnosed and suspected scrub typhus cases at acute and convalescence phases in Menghai from June to September in 2011. Nested polymerase chain reaction (nPCR) was conducted to detect the groEL gene of Orientia tsutsugamushi (Ot) in blood clots from patients at acute phase. Indirect immunofluorescence assays (IFA) were conducted to detect IgG antibodies against Ot in sera from patients. Results A total of 36 blood clot samples were tested with PCR, and 25 samples were positive woth Ot nucleic acid. The groEL gene fragments of 14 positive samples were cloned and then sequenced. According to the homology and phylogenetic analysis; the 14 strains shared 99%-100% homology of nucleotide and 100% homology of amino acid. They were very close to and shared high homology with the strains BJ-TZ-OT-O39, AH-GD-OT-S6, UT213, Kato and SH205 from GenBank. Of 17 patients detected at both acute phase and convalescence phase, 11 had a 4-fold increase in their Ot-IgG titer by IFA. Overall, 26 cases were diagnosed with scrub typhus (15 molecular biological confirmations and 11 serological confirmations). Conclusion The serological and molecular biological detections confirmed the transmission of scrub typhus in Menghai. Molecular epidemiological analysis showed that the circulating strains of Ot in Menghai was with stable genetic characteristics and obvious regional characteristics.
Key words: Scrub typhus     Surveillance     Nested PCR     Immunofluorescence assay     Laboratory diagnosis    

恙虫病(scrub typhus)是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot)引起的急性传染病，病原体可在多种鼠类和恙螨中保存和传播，是一种典型的自然疫源性疾病。患者以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征，严重者可导致多脏器损伤并死亡。恙虫病在我国广泛分布，主要分布在南方地区，近几年北方省区也有本病流行[1]。云南省是我国恙虫病主要流行地区，主要分布在西部和南部地区[2]。西双版纳州勐海县位于云南省西南部中缅边境地区，以往该县常有恙虫病临床诊断病例报告 ，但缺乏实验室诊断，为确定恙虫病流行状况，笔者于2011年在勐海县采集恙虫病患者血液标本，用间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay，IFA)和巢式聚合酶链反应 (nested polymerase chain reaction，nPCR)分别检测Ot-IgG抗体和核酸并进行序列测定和分析，以期了解恙虫病的分布特点，为防控措施的制定提供科学依据。 1 对象与方法 1.1 对象

在勐海县医院、勐混卫生院和勐宋卫生院进行调查，2011年6月下旬至9月上旬期间，临床诊断为恙虫病、疑似恙虫病和立克次体感染的住院病例作为调查对象。所有病例均进行病史个案调查并采集血液标本做特异性抗体和核酸检测。本研究恙虫病实验室诊断病例需符合以下两项条件：①具有发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大或皮疹等临床症状和体征；②急性期凝血块Ot核酸阳性和/或急性期和恢复期血清Ot-IgG抗体滴度呈现4倍及以上增长。 1.2 标本采集

用无菌真空采血管采集患者静脉血液，经3000 r/min离心10 min，血清和凝血块分别置于2 ml螺旋盖冻存管，-70 ℃冰箱保存。共采集到36例病例的急性期血液标本(凝血块)，其中17例病例采集到急性期和恢复期双份血清。 1.3 IgG抗体检测

采用IFA法检测患者血清中Ot-IgG抗体[3]，抗原片为本实验室自制，阳性对照血清为本实验室保存的以往恙虫病患者血清。IgG抗体滴度≥1 ∶ 80为阳性。 1.4 nPCR试验

对急性期患者的血液分离血清后剩余的凝血块提取DNA并采用nPCR法检测Ot热休克蛋白基因(groEL)。DNA提取采用QIAmp DNA Mini Kit试剂盒按说明书进行。nPCR引物序列引用参考文献 ：外引物A：5′-AAG AAG GA/CGT GAT AAC-3′；外引物B：5′-ACT TCA/CGT AGC ACC-3′；内引物C：5′-ATA TAT CAC AGT ACT TTG CAA C-3′；内引物D：5′-GTT CCT AAC TTA GAT GTA TCA T-3′。第1轮扩增应用引物A和B，第2轮扩增应用引物C 和D。扩增条件均为94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。扩增30个循环。正常人DNA及无菌水作为阴性对照，Ot Karp 型(福建省CDC惠增)DNA作为阳性对照。扩增预期片段长度为364 bp。 1.5 序列测定和分析

所有测序均在上海生工生物技术有限公司完成。采用ClastalX1.83进行核苷酸序列比对，采用DNAstar中MegAlign软件包进行核苷酸和氨基酸同源性分析；采用Mega 4.0 软件，基于邻接法构建系统进化树。本研究序列分析引用了GenBank中12株Ot groEL基因核苷酸序列，见表 1。

表 1 序列分析引用的Ot groEL基因核苷酸 序列背景信息 Table 1 Background information of groEL sequence of Ot used in this study
菌株来源(1)地域年份基因序列
UT213IUThailand2007EF551301
Jin/2012humanZhejiang,China2013KC485338
KatoIUJapan2012JX188393
AH-GD-OT-S6sheepAnhui,China2009GQ499933
BJ-TZ-OT-O39oxChina,Beijing2009GQ499952
M31887IUAmerican1990M31887
YoungworlIUKorea2002AY191588
FY1humanFuyang,China2009GQ468797
KawasakiIUKorea2002AY191587
ShimokoshihumanJapan2012JX188395
Liu/2011 humanZhejiang,China2013KC485339
SH205Apodemus eciosusJapan2013KC688332
注：(1)IU： 不详。
表选项
2 结果 2.1 Ot-IgG抗体检测

对勐海县采集到的17例病例双份血清经Ot-IgG抗体检测，其中11例病例的恢复期血清IgG抗体滴度(1 ∶ 160～1 ∶ 1280)大于急性期血清IgG抗体滴度(≤1 ∶ 80)4倍及以上，另外6例病例无论急性期或恢复期血清均为阴性。 2.2 Ot groEL基因检测

对勐海县采获的36例急性期患者(发病日期至采血日期间隔1~7 d)的凝血块标本经PCR扩增，阳性25份。25例Ot核酸阳性病例发病到采血间隔时间为1~7 d，中位数为4.6 d。 2.3 病例流行病学分析

根据上述检测结果并结合流行病学和临床表现，26例患者被诊断为恙虫病(双份血清IgG抗体滴度4倍增长11例，核酸阳性15例)。上述26例病例分布于4个乡镇，其中勐海镇3例，勐混9例，勐宋9例，布朗山5例。发病月份分布：6 9月分别为3、7、15和1例。其中，8月病例占总病例数的57.69%。性别分布：男9例，女17例，男女性别比为1 ∶ 1.89。年龄分布：0～10岁组2例，11～20岁组5例，21～30岁组8例，31～40岁组3例，41～50岁组1例，51～60岁组6例，61～70岁1例；年龄最大者65岁，最小者5岁，以女性中青年为主。 2.4 同源性和系统进化分析

经Ot groEL基因序列测定，从勐海县恙虫病患者中获得14株(YNMH013、YNMH018、YNMH026、YNMH041、YNMH070、YNMH077、YNMH087、YNMH093、YNMH095、YNMH096、YNMH103、YNMH104、YNMH107和YNMH109)的groEL核苷酸序列。同源性分析表明，14株Ot之间核苷酸同源性在99%~100%，氨基酸同源性均为100%，表明它们之间高度同源，具有明显的地域特征。本次分离的14株Ot与AH-GD-OT-S6(安徽)、BJ-TZ-OT-O39(北京)、UT213(泰国)及Kato和SH205株(日本)热休克蛋白核苷酸(99.0%～100%)和氨基酸(100%)高度同源；与Jin/2012(浙江)、FY1(安徽阜阳)、Kawasaki(韩国)、Youngworl(韩国)、M31887株(美国)核苷酸(92.3%～93.3%)和氨基酸(94.9%～100%)同源性较低；与Shimokoshi株(日本)核苷酸(87.9%～88.9%)和氨基酸(90.9%)同源性最低。

进化树分析显示，勐海县这14株Ot与BJ-TZ-OT-O39、AH-GD-OT-S6、UT213、Jin/2012、Kato、SH205和M31887亲缘关系较近，同在一个大分支上；与FY1、Liu/2011、Kawasaki、Youngworl和Shimokoshi株亲缘关系较远，见图 1。

图 1 云南省勐海县14株Ot groEL基因进化分析 Figuer 1 Phylogenetic analysis on groEL sequences of 14 strains of Ot from Menghai and 12 strains from GenBank 注：▲： 本研究勐海县Ot 分离株
图选项
3 讨论

恙虫病在云南省分布广泛，主要分布在低海拔 的河谷平原或江河峡谷地区，黄胸鼠(Rattus flavipectus)为主要宿主，地里纤恙螨(Leptotrombidium deliense)为主要传播媒介[2]。勐海县位于云南省西南部，西双版纳州西部，与缅甸接壤，国境线长146.6 km。勐海县辖11个乡镇，人口31.24万，总面积5511 km2，其中山区面积占93.45%，坝区面积占6.55%，最高海拔2429 m，最低海拔535 m。属热带西南季风气候，年平均气温18.7 ℃，年平均降雨量1341 mm，适于黄胸鼠和地里纤恙螨的分布。黄胸鼠在云南省西南部地区广泛分布，属居民区优势鼠种[6,7] 。以往调查，西双版纳地区黄胸鼠构成比为94.21％[7,8] ，本次病例调查的同时，我们还在勐海县恙虫病流行区的居民区进行宿主动物调查，结果捕获的100只鼠类均为黄胸鼠，表明黄胸鼠为当地优势种。本次实验室检测证实，勐海县的勐海、勐混、勐宋和布朗山乡(镇)存在恙虫病流行，虽然本次调查未能覆盖全县11个乡镇，但根据自然地理概况和宿主媒介分布特点，推测恙虫病在勐海县广泛分布。

由于恙虫病特异性诊断试剂的缺乏，云南省乃至全国报道的恙虫病大多为临床诊断病例。根据本次实验室证实的26例恙虫病的临床诊断分析，其中仅有11例被诊断为恙虫病，其余被分别诊断为斑疹伤寒(8例)和立克次体感染(7例)，临床诊断和实验室诊断符合率仅为42.31%(11/26)，表明误诊、漏诊普遍存在，其他流行区也极有可能存在同样问题。因此，为了及时有效诊治及控制恙虫病流行，需要加强疾控和医疗机构恙虫病等立克次体病实验室监测能力建设。

Ot可以分为多种血清型或基因型，我国主要分布有Karp、Kato和Gilliam型[9]。本次序列分析表明，勐海县14株Ot与Karp和Kato型菌株同源性均较高，而与其他型别同源性较低，提示勐海县流行株可能属Karp或Kato型，由于本次序列分析仅使用较为保守的groEL基因，下一步尚需开展深入的序列测定和分析，以确定当地流行株的基因型。

参考文献
[1] Zhang LJ, Fan MY. Rickettsiosis and Rickettsial disease in China[M]//Zhang LJ. Contemporary Rickettsiosis and Rickettsial disease. Changchun: Jilin University Press,2010,170-171. (in Chinese) 张丽娟,范明远. 中国立克次体与立克次体病研究现状[M]//张丽娟.当代立克次体学与立克次体病. 长春:吉林大学出版社,2010,170-171.
[2] Zhang HL. Research progress on epidemiology of rickettsia disease in Yunnan, China[J]. Endenic Diseases Bulletin,2001,16(2):86-88. (in Chinese) 张海林. 云南省立克次体病流行病学研究现状及展望[J]. 地方病通报,2001,16(2):86-88.
[3] Eremeeva ME, Balayeva NM, Raoult D. Serological response of patients suffering from primary and recrudescent typhus: comparison of complement fixation reaction, Weil-Felix test, microimmunofluorescence, and immunoblotting[J]. Clin Diagn Lab Immunol,1994,1:318-324.
[4] Fu XP, Zhang JS, Shen XJ, et al. Surveillance on rickettsia in epidemic areas of scrub typhus in Xinyang areas of Henan province[J]. Chinese Journal of Epidemiology,2007,28(6):547-549. (in Chinese) 付秀萍,张景山,申晓靖,等. 河南省信阳地区鼠类感染立克次体的调查[J]. 中华流行病学杂志,2007,28(6):547-549.
[5] Fu XP, Liu YY, Zhang BH, et al. Laboratory confirmation of scrub typhus outbreak in Pinggu district, Beijing[J]. Chinese Journal of Vector Biology and Control,2011,22(2):137-140.(in Chinese) 付秀萍,刘玉英,张宝华,等. 首次实验室证实北京平谷地区恙虫病东方体暴发流行[J]. 中国媒介生物学及控制杂志,2011,22(2):137-140.
[6] Yunnan provincial office for endemic diseases control and prevention. Directory of animal associated with the disease in Yunnan[M]. Kunming: Yunnan Science and Technology Press,1989. (in Chinese) 云南省地方病防治办公室. 云南医学动物名录[M]. 昆明:云南科技出版社,1989.
[7] Zhang YZ, Zhang HL, Yang WH, et al. Investigation of hemorrhagic fever with renal syndrome in the lower reaches area of Langcang River, Yunnan province[J]. Endenic Diseases Bulletin,2000,15(4):43-44.(in Chinese) 张云智,张海林,杨卫红,等. 云南省澜沧江下游地区肾综合征出血热调查[J]. 地方病通报,2000,15(4):43-44.
[8] Fan JH, Xu YQ, Shen JB. A study on epidemic situation and control strategies of plague in the Xishuangbanna Dai Atutonomous Prefecture[J].Chinese Journal of Control of Endemic Disenaces,2012,27(3):217-219.(in Chinese) 范建华,许云桥,申剑波. 西双版纳傣族自治州鼠疫流行现状及防制对策探讨[J]. 中国地方病防治杂志,2012,27(3):217-219.
[9] Huang JT, Yu ES. Scrub typhus[M]//Yu ES. Zoonoses in China. Fuzhou: FuJian Science and Technology Press,1996: 481-502.(in Chinese) 黄捷通,于恩庶. 恙虫病[M]//于恩庶. 中国人兽共患病学[M]. 福州:福建科学技术出版社,1996:481-502.