丙型病毒性肝炎(丙肝)病毒(hepatitis C virus，HCV)是丙肝的病原体，主要通过血液或血液制品传播。HCV感染者自然阴转率低，抗感染疗效差，50%～85% HCV感染者多进展为慢性肝炎、肝硬化、甚至肝细胞肝癌(hepato cellular carcinoma，HCC)^{[1, 2]}，严重威胁人类健康。因此，针对HCV感染及其实验诊断的研究备受关注。

HCV是一种具有包膜结构的单股、正链、线状RNA病毒。1989年东京国际病毒性肝炎研讨会将“非甲非乙型肝炎”命名为丙型肝炎(Hepatitis C，HC)。1991年国际病毒命名委员会将其归于黄病毒科(Flaviviridae)丙型肝炎病毒属(hepatitis C virus)。HCV病毒颗粒直径约 30 ~ 60 nm，表面披有包膜及棘突，与黄病毒十分相似。主要在肝细胞中复制^[3]。

HCV基因组全长约9400 ~ 9600 bp，由分别位于5′末端和3′末端的非编码区序列(untranslated regeion，UTR)及其中央部位的一个开放性阅读框架编码区(Open reading frames，ORF_S)组成编码一个大约3000 个氨基酸的多聚蛋白前体。ORF包括结构蛋白区和非结构蛋白区。依据HCV基因序列同源性，目前全世界范围内已克隆到的分离株可分为6个基因型(genotypes)，50个亚型(subtypes)^[4](也有报道其基因亚型已超过100余个)；及若干准病毒株(quasispecies)。其感染机制尚未确切阐明，预防和控制丙肝传播的重要手段之一是临床早期明确诊断，及时抗病毒治疗。本文概述了HCV感染的实验诊断技术及方法学(包括ELISA、RIBA、 CLIA、 DIFA、real-time PCR 和RT-LAMP)及其临床应用。 1 HCV抗体的检测 1.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)

感染HCV 之后，被感染者体内可出现应答性抗体(主要为抗HCV-IgG 型；抗HCV-IgM出现较早，但持续时间短)，且病程越长、HCV-Ab 的阳性检出率越高。因此，抗-HCV检测结果阳性，提示可能为HCV感染，但也有可能是假阳性反应(Hitxler 的研究提示，HCV-Ab 检测存在10.0%～54.5%的假阳性率和11.0%～22.2%的假阴性率)。

抗-HCV检测出现假阳性反应究其原因主要有，高免疫球蛋白G血症、类风湿因子的干扰、超氧化物歧化酶的干扰或用于试剂制备的HCV抗原不纯等。需要应用RIBA或者HCV-RNA以确证试验结果。美国疾病预防控制中心建议^[5]应用S/CO比值(Signal-to-Cut-Off)表示ELISA检测抗-HCV的试验结果。当筛检试验阳性、且S/CO值≥3.8的血清标本约有95%者为阳性，报告为抗-HCV阳性，可以不做确证试验；筛检试验阳性、但S/CO值<3.8的标本应进行确证试验。

抗-HCV检测阴性，可以排除HCV感染。但是，HCV-Ab的产生有一个明显的HCV感染后血清阳转前的窗口期(Preseroconversion window phase，PWP)。目前第3代抗-HCV EIA检测试剂，其窗口期仍有58 d。所以，当抗-HCV检测结果阴性时，也应该考虑到正处在HCV 感染窗口期的感染者可能会出现的漏检者。尤应重视免疫力低下和血液透析患者等特殊人群，他们感染HCV后产生抗体的窗口期较长，且抗体水平较低。

国际上应用的抗-HCV EIA 检测试剂已发展到第三代(相应地RIBA检测试剂也已改进)，由3组HCV重组抗原组成，是一种包括Core、NS3、NS4和 NS5组成的混合抗原用以包被酶标板。进一步提高了抗-HCV检测试验的敏感性和特异性，试验方法简便，但抗体检测无法区别HCV急性或者慢性感染。国产丙肝诊断试剂评价质控体系的建立^[6]，为新研制和改进后的国产丙肝诊断试剂的标准化和性能评价提供了参考依据，抗-HCV EIA检测已经广泛应用于献血者的筛检以及临床试验诊断中。 1.2 重组免疫印迹试验(recombinant immunoblot assay，RIBA)

CHIRON RIBA HCV 3.0 试剂是RIBA 检测丙肝的方法之一，广泛应用于世界各国，被公认为HCV抗体确证的实验室“金标准”^[7]该实验的原理是在硝酸纤维素膜条上预先包被HCV合成抗原、重组抗原(Core、NS3、 NS4、 NS4-B、 NS5)及对照试验线蛋白(对照1、2)，将硝酸纤维素膜条浸在已稀释的血清或血浆样品中反应后，加入酶标记的抗人IgG抗体温育。如果血清中含有HCV特异性抗体，则会形成“包被抗原-抗体-酶标二抗”的复合物，加入底物液显色，终止后，根据出现的不同条带情况，判读试验结果。RIBA敏感度较低，试验操作方法复杂，但具有高特异度，RIBA阳性可以确证抗-HCV 阳性结果。但因试剂价格昂贵，国内实验室尚未普遍应用。我国已有初步研究成功重组免疫印迹方法检测抗-HCV 试剂(简称CWT)。陈俊梅等^[7]对上述二种RIBA试剂进行了比较研究，检测结果显示两者一致率为 99.16%，具有很高的一致性(kappa=0.98)。研究表明，上述两种试剂特别适用于非甲-非戊型肝炎患者中的 HCV 感染的诊断。对丙肝抗体试验的补充检测主要是为了解决ELISA存在的假阳性，对ELISA 阳性样本确证其抗-HCV抗体的状态，进一步提高了对检验结果的质量保证。 1.3 斑点免疫渗滤试验(direct immuno floresecnce assay，DIFA)

DIFA是一种直接免疫荧光试验，用于快速检测血清中的抗-HCV。该试验是将待检的血清直接滴加在固定有HCV-Core抗原的滤纸上，充分渗滤后再加入酶标抗体，继后加入底物显色，观察滤纸上的斑点反应。此后，又在DIFA原理的基础上推出了斑点免疫层析试验(dot immuno chromatographic assay，DICA)，即将多种试剂等固定在同一试纸条上，加入待检测的血清样本，进行“层析”试验。该方法简便、快捷。但鲜有临床应用DIFA检测HCV-Ab的研究文献报道。 1.4 化学发光免疫分析(chemi luminescence immuno assay，CLIA)

CLIA技术是应用化学发光剂直接标记抗原或抗体，与待测标本中相应的抗体或者抗原、磁颗粒性的抗原、抗体反应；通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物分开，然后在结合状态部分中加入发光促进剂进行发光反应，通过对结合状态发光强度的检测进行定性或者定量检测。该技术采用了化学发光结合磁性微粒子分离技术，并可使用全自动化学发光免疫分析仪进行检测。使得检测目的物的试验敏感度、分析速率均显著优于其他检测技术；且因为CLIA 技术操作简单、便捷、高速率，结果准确可靠，又可以高度自动化、也不污染环境，已广泛应用于多种病原微生物感染的实验诊断^[8]。

陈雅斌等^[9]应用 CLIA 对 31 551 例就诊患者和健康体检者进行抗HCV检测。 在319例抗-HCV阳性者中，发现可溯源相关病史的患者同时也并发有肝脏疾病或者其他疾病；分布于具有输血史、手术史、血液透析史、乙肝病史、吸毒史和母婴传播多种途径的患者。研究证实：除了血液传播途径以外，其他传播途径亦不容忽视，对于无临床肝炎症状的人群也应作为常规检测。

姚仁南等^{[10, 11, 12]}应用CLIA 检测献血者的抗-HCV，(以及HCV-RNA)。并与常规的ELISA、real-time PCR 进行比较研究。检测结果表明，CLIA与ELISA二种试剂盒的初检、复检抗-HCV阳性检出率的符合率分别为93.33%、87.50%；CLIA与real-time PCR的 HCV-RNA阳性检出率比较，其阳性符合率为92.86%。作者还应用CLIA 技术对ELISA 检测抗-HCV试验结果在临界值附近(0.4≤S/CO<1)的血清样本进行了核实检验，结果显示：CLIA技术的试验敏感度显著地高于ELISA试剂1、2(P<0.05；P<0.01)和胶体金试验(P<0.01)。

鉴于国内CLIA技术检测HCV-Ab试验结果的解释，尚无统一的实验标准或者技术指南所规范，对于HCV-Ab 筛查呈反应性的标本的确证试验问题的认知，有学者建议^[13]CLIA 法 抗-HCV 检测值(S/CO)>20.01者，可以直接检测 HCV-RNA，以确认是否有病毒复制及是否进行抗 HCV 治疗。而S/CO值≤20.0者，当有输血、手术、吸毒等高危情况的患者或有肝功能异常的患者建议进一步检测HCV-RNA；而无输血、手术、吸毒等高危情况且肝功能正常的患者可以建议其定期接受观察和随访。根据CLIA 法筛查HCV-Ab 结果的S/CO 值判读 HCV-RNA 结果对于临床医生为患者合理解释实验检测结果和进一步的检查建议具有重要的指导意义。也可有效降低CLIA法检测 HCV 的假阳性率。但实验室内的质量控制尤为重要。 2 HCV核心抗原的检测

HCV-核心蛋白的氨基酸序列十分保守，在已分离的HCV 病毒株氨基酸序列的比较研究表明，它们的同源性>95%。作为HCV急性感染病程中患者体内产生的早期感染的标志HCV-核心抗原几乎与HCV-RNA 同时出现，且与其动力学变化密切相关，而且HCV 基因型之间差异无统计学意义^{[14, 15]}。HCV-核心抗原检测可以将HCV感染检出的时间平均提前14~ 60 d。但是，当感染者机体出现应答性抗体后，核心抗原与抗体结合，核心抗原阳性检出率逐渐降低、直至不能检出。所以，应用HCV-Ag检测的同时，联合HCV-Ab 检测可以进一步提高HCV 感染者的阳性检出率。如果用于献血员的筛检，也可进一步提高用血安全性。 2.1 量子点(quantum dots，QD)技术

QD是一种新的纳米材料。QD生物标记试剂与传统荧光染料试剂比较具有半衰期长、在单色光源激发下可同时激发多种不同材质及微粒的量子点产生的荧光、发射光谱窄而对称、单色性优、表面易修饰等显著特点。李蒙等^[16]采用针对HCV核心抗原不同抗原决定簇的单克隆抗体分别包被量子点与磁微粒，以夹心法结合待测标本中的抗原，预先完成用抗体对量子点及磁微粒的标记后，检测目标抗原所需时间仅30~40 min，检测灵敏度最低可达 5 ng/ml；与PCR检测HCV-RNA 比较，其特异度为96.50%，敏感度与ELISA检测结果无显著性差异。该技术试验操作便捷、所需设备简单；且与HAV抗体、HBV表面抗原阳性标本无交叉反应；也不受脂血、溶血、黄疸等的干扰。 2.2 ELISA

应用双抗体夹心ELISA 检测HCV-Ag 技术已比较成熟，具有一定的敏感性和特异性，但耗时较长。此外，当感染者机体出现应答性抗体后，核心抗原与抗体结合，核心抗原阳性检出率逐渐降低、乃至不能检出，导致HCV-核心抗原的检测用于无偿献血者HCV-RNA阳性血液样本检测时往往出现“0”结果。因此，HCV感染实验诊断有必要HCV-Ab/HCV-Ag；或者HCV-Ab/HCV-RNA的联合检测^{[17, 18, 19]}，以进一步提高HCV感染的阳性检出率。 2.3 CLIA

CLIA 技术已广泛应用于多种病原微生物感染的实验诊断^[8]。CLIA自动检测核心抗原的方法，对HCV-RNA阳性标本HCV核心抗原的检出率可达97.5%^[20]。向明确等^[21]随机选取接受HCV-Ab检测的215例血标本。首先采用RIBA检测HCV-Ab，根据检测结果分为HCV-Ab阳性组和HCV-Ab阴性组。采用化学发光微粒子免疫检验技术(CMIA)同时检测两组的游离HCV-Ag、总HCV-Ag以及HCV-RNA。研究结果的统计学差异均具有统计学意义(P<0.01；P<0.05)。而对比HCV-Ag与HCV-RNA检测结果的阳性符合率高达94.4%，可见HCV-Ag检测是对HCV-RNA检测的有力补充，有利于HCV 感染的临床早期诊断。 3  HCV核酸(HCV-nucleicacid，HCV-NA)的检测

HCV 急性感染后1~2周，感染者体内就会出现HCV-RNA，即HCV病毒血症。随之，病毒载量逐渐增高，抗-HCV阳转前达到峰值。但随着抗体阳转，病毒载量就逐渐降低，直至阶段性消失。如果急性感染发展到慢性，则HCV-RNA水平保持相对稳定，也存在短暂的病毒载量低于实验检测下限的情况。HCV-RNA的定性、定量分析，对抗-HCV阳转前的急性感染、以及免疫力低下人群HCV感染的诊断、区分急性/慢性感染与已恢复的感染和规范抗病毒治疗都具有重要的临床意义^[20]。因此，血清标本HCV-RNA定性检测结果阳性，是HCV感染的直接依据，而HCV-RNA载量则反映了HCV复制的活跃程度和患者病变状况，是诊断HC，并判断抗病毒疗效的重要指标。

但是，亦有某些隐匿性HCV感染者血清HCV-Aｂ和HCV-RNA检测结果均为阴性。然而，从感染者肝细胞或外周血单个核细胞(Periphera blood mononuclear cell，PBMC)中可检测到HCV-RNA，应用干扰素治疗有效。Rasmussen等^[22]研究发现HIV/HCV合并感染者与单一HCV感染者比较，合并感染者PBMC及肝细胞中可能存在特有的基因表达。因此，定量检测HIV/HCV合并感染者PBMC中 HCV-RNA 有助于临床明确诊断、及时治疗。应是令学者感兴趣的热点研究课题。

应用HCV-RNA 检测临床输血的研究结果提示HCV的残余风险已降低至约0.003%^[23]。虽然HCV-RNA 检测具有敏感度高、窗口期短的优点，但该检验技术对于检验仪器、设备、人员、环境有着很高的要求。且核酸检验试剂价格昂贵，易于污染造成假阳性，RNA不够稳定，对于样本的存储条件要求也高。 3.1 实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)

反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测HCV-RNA的检出下限为50 IU/ml；而real-time PCR检出下限可达5~30 IU/ml。特异性达99%^[20]。该实验方法敏感、特异、准确，且重复性好、线性范围宽，已作为常规的HCV-RNA定性、定量检测技术。王文博等^[24]应用real-time PCR方法的最低数值可以检测出10个copies/ml；而ELISA检测HCV阴性的献血者未检测到HCV-RNA。吴斌等^[25]应用实时荧光定量PCR和ELISA检测血清样本，抗HCV和HCV-RNA阳性检出率分别为78.8%和54.2%(P<0.05)，HCV-RNA的平均载量为4.85×10⁵ copies/ml；研究表明抗-HCV和HCV-RNA联合检测具有对HCV感染的早期诊断价值。

real-time PCR 的试验原理^[26]：是以荧光共振能量转移原理为基础。根据荧光探针发光基团所发出 的荧光强度与PCR产物的量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样本的Ct值，即可从标准曲线计算出该样本的起始拷贝数。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR可以利用信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物量的变化，可以对初始模板量进行定量检测分析。 3.2 荧光定量-环介导反转录等温扩增技术(reverse loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)

LAMP 是一种等温扩增技术，国内已经广泛应用于多种病原体的分子生物学诊断，取得满意成果，似有取代PCR技术的趋势。张永乐等^[27]采用荧光定量RT-LAMP技术检测HCV病毒核酸基础上，利用LAMP的高灵敏度和操作方法简易的特点，同时又结合了荧光染料在密闭的反应管中进行定量检测，从实验源头上降低了其产物对实验室的污染。更重要的是检测过程中不再需要溴化乙啶显色和在紫外线下观察实验产物，从而，保证了试验操作者的安全。其实验原理是在LAMP反应体系中加入SYBR Green Ⅰ染料，在扩增过程中通过检测反应管中的荧光值，进行定量。该技术的检出下限已达到10 IU/ml，其敏感度显著高于荧光定量PCR技术，可能与该研究选择应用了HCV 病毒基因 5′ UTR 区域相对保守段设计的RT-LAMP有3对引物密切相关。RT-LAMP是一种便捷、敏感、特异性高的快速检测基因的方法，将可能会广泛应用于感染性疾病等的临床早期诊断。同时，其精确的定量还可以为抗感染治疗予以临床指导。在疾病的预防和控制以及疾病监测中具有广阔的应用前景。 3.3 磁珠法在HCV-RNA

定量检测中的临床应用 国内吴斌等^[28] 对288例慢性丙肝(chronic hepatitis C，CHC)患者的血清样本，分别采用磁珠法核酸提取荧光定量PCR 检测试剂和目前国内主流的柱提取试剂测定HCV-RNA 病毒载量；采用ELISA测定 抗-HCV。研究结果显示，柱提取法的阳性率为 40.63%；磁珠法的阳性率为 41.67%(P>0.05)；但在低病毒载量组中，柱提取法有3例未检出，而磁珠法检测这3例丙肝患者标本为阳性。表明两种核酸提取试剂及方法在中、高病毒载量组中，具有较好的一致性，但在低病毒载量组中，磁珠法灵敏度更高，具有较高的临床应用价值。因此，HCV-RNA 提取技术的不同，亦有可能影响到病毒核酸载量的定量检测。 4 HCV基因型及基因亚型的检测

HCV具有高度变异性，在长期的遗传和变异中 逐渐形成了不同的基因型、基因亚型，以及基因亚型下的变异。从而，导致HCV的持续性感染以及免疫逃逸，影响丙肝的防治。CHC治疗的标准方案是聚乙二醇干扰素α(PEC-IFNα)联合利巴韦林(RBV)，治疗的终点是获得持续性病毒学应答(sustained virologic response，SVR)，即治疗结束24周以后血清中检测不到HCV-RNA。HCV基因型是最重要的基线指标，不同基因型患者的病毒学应答率差异显著。例如1、4型SVR较差，属于“难治性HC”。所以，在抗HCV治疗前检测HCV基因型甚至基因亚型，以制定患者个体化的治疗方案，使其有最大可能获得SVR的同时，避免因过度治疗而承受不必要的药物不良反应和经济负担^[29]。因此，HCV基因型的检测具有重要地临床意义。

HCV基因及其亚型的检测，是根据其基因组核苷酸序列的差异进行分型。Simmonds等^[30]以HCV基因组非结构蛋白区-NS5B为分型区，应用核酸测序和系统进化分析建立的HCV分型命名方法已经被世界各国多数实验室采用。对两个以上的区域例如5′UTR与C区、E1与NS5B区、或E1与C区，直接进行测序和系统进化分析，可以提高分型检测结果的准确性及成功率，基因分型结果也更为广泛，但其准病毒毒株的变异主要表现为基因亚型下的变异，应用基因分型的方法很难将各种不同的毒株予以区分，必须继续进行多态性的研究。目前在对HCV感染的基因诊断和抗病毒治疗中多以该区序列为基础。如RT-PCR检测试剂所采用的引物均以其序列为依据设计，扩增的产物为5′UTR的片段。全基因序列分析是HCV基因分型的“金标准”^[31]。张海莹等^[32]对CHC患者血清基因型与HCV-RNA相关性的研究结果表明：我国HCV感染以1b基因型(59.70%)为主，其次为基因2型(15.50%)。与国内多数学者的研究结果较一致。基因型在性别分布上的差异无统计学意义。基因1b型HCV-RNA病毒载量高于基因3型；基因2型、6型HCV-RNA病毒载量也均高于基因3型。提示抗病毒治疗前HCV基因型与体内病毒载量密切相关，这也可能是基因型影响CHC治疗和预后的一个重要原因。

亦有学者如Pawlotsky^[33]认为 “HCV病毒载量可以作为估计患者肝脏中HCV复制水平的参数，但特定时间的HCV-RNA滴度不能作为预测肝脏损伤的严重程度和判断预后的指标”。说明HCV-RNA载量的高低与其感染的严重程度、疾病的进展并无绝对地相关性。但是，对于免疫功能低下者如HIV 感染人群可以因为肝脏疾病而死亡，其主要死因是合并HCV感染。HIV/HCV 合并感染较单一HIV感染者更易进展为肝坏死，同时也加剧了AIDS 的病变进程。此外，HIV感染者多有从事有偿输血、或者(共用针具)注射毒品者，因免疫功能低下导致HCV的重复感染，因此，这一人群HCV-RNA检测结果显示为较高的多种基因型重叠感染的阳性检出率^{[34, 35]}，应予以密切关注。

HCV基因型和基因亚型的检测主要应用分子生物学技术，但目前仅可对1~6种基因型进行分析，而对不同亚型的区分能力有限，检测结果尚不够准确。 4.1 real-time PCR 廖峭等^[36]收集无偿献血人群中抗-HCV阳性标本605份，应用real-time PCR技术进行核酸及病毒载量检测，阳性标本作NS5B基因扩增；核苷酸序列测定后，应用DNAstar等软件作序列分析和基因分型；同时对病毒载量与基因型(及亚型)的相关性进行了分析。检测结果显示，广州地区无偿献血人群中HCV1b和6a为主要亚型，且其病毒载量高于其他亚型。研究表明这一检测技术敏感、特异、准确、重复性好，且在各个基因型之间无差异。但是，HCV-RNA检测的敏感度尚不理想；实验操作技术比较复杂；影响试验结果的因素也较多，实验的标准化尤为重要。应严格技术操作规程，避免RNA酶的污染，保证所扩增的目标产物的特异性以及对RNA的精确定量；选用适合实时定量PCR的反转录酶及其高特异性引物设计；选择合适的内标基因或者内标基因组合。 4.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)分析

RFLP是基因诊断常用的技术。所谓RFLP是指人类在进化中，DNA序列发生了中性突变，因而导致某些限制性内切酶识别位点获得或者丢失。当用这些限制性内切酶消化基因组DNA时，即可获得长度呈多态分布的DNA片段。PCR-RFLP就是利用PCR扩增具有不同酶切位点的各种HCV基因型，将PCR产物用几种不同限制性内切酶(如AluⅠ、HaeⅢ、ApaⅠ)进行酶切，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切片段；将电泳检测结果与已知的限制性片段数据库进行检索、比较，以确定HCV的基因型及基因亚型。该技术具有特异、敏感、简便、实用的优点；且检测结果稳定、重复性好，基层实验室可以开展。但试验可应用的内切酶较少，用于内切的位点也有限。 4.3 序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-Scquence specific primer，PCR-SSP)

PCR-SSP是一种基因多态性分析技术，已广泛应用于人类白细胞抗原(HLA)，ABO血型系统，以及器官移植、法医学等具有基因多态性的基因分型。鉴于HCV 基因型在某一区段其序列存在的差异，(多选择C区、NS5B区)，设计一系列的序列特异性引物，HCV不同基因型及亚型可籍PCR-SSP可以扩增出不同长度的片段，据此即可进行分型^[37]。试验操作较为简便，成本相对较低、亦不需特殊器材。但试验结果有时较难判读。 4.4 聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针杂交技术(PCR-sequence-specific oligonucleotide，PCR-SSO)

根据HCV基因型及亚型序列的差异，对不同型别HCV 序列比对，依据其Tm 值、发夹结构、二聚体、杂交体的结合能参数，以5′UTR 为靶序列，设计HCV 各基因型的型特异性探针。其载体可用玻片、纤维素薄膜、微孔板等。应用real-time PCR 技术扩增经过生物素、荧光分子标记的引物HCV 基因片段；其扩增产物与载体上的特异性探针进行杂交^[38]。通过凝胶电泳显示或者酶联显色反应或扫描仪读取检测结果，以确定其基因型。 4.5 聚合酶链反应-分型测序(PCR-se-quence-based typing，PCR-SBT)

该技术是采用特异性PCR引物扩增HCV基因组的多个区域(E1、NS5B、C)，同时结合多区域的测序结果描绘其基因序列进化树。其获取的碱基序列信息量大，可以明确显示被检测区域的多态性，且可能获取新的基因信息；因为该技术具有高分辨率、高特异性，是其他实验检测基因技术的标准参考方法。主要应用于临床和实验室研究。 4.6 聚合酶链反应-核酸液相芯片分型技术(PCR-nucleic liquichip typing techniques，PCR-NLTT)

周有良等^[39]研用PCR扩增及核酸探针偶联的方法，将PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交，建立了HCV核酸液相芯片分型检测方法。该技术能对6种HCV亚型进行检测和分型，对HCV 1a、3a和6a亚型核酸液相芯片分型检测方法的灵敏度为1×10⁵ copies/PCR；对HCV 1b、2a和3b亚型的灵敏度为1×10⁴ copies/PCR。对93例临床血清样本的检测结果表明，具有高通量、快速、敏感、特异的特点。 5 结语

HCV感染实验诊断技术和方法学研究表明，血清HCV-RNA 定性检测结果阳性，是HCV感染的直接依据，而HCV-RNA载量则反映了HCV复制的活跃程度和患者病变状况，是诊断丙肝、并判断抗病毒疗效的重要指标。HCV基因型及基因亚型的检测，在HCV感染的分子流行病学研究及其变异趋势、传播途径、尤其对于指导临床丙肝患者个体化治疗、预测疗效及预后，都具有重要意义。实验研究也提示，HCV感染者随着血清ALT 值的升高，抗-HCV阳性率亦呈显著升高趋势。且HCV-RNA载量与ALT 水平呈正相关^[40]。血清PIVKA-Ⅱ(Protein induced by vitamin K absence or antagonist；PIVKA-Ⅱ)^[41]则具有HCV 感染所致的HCC标志物的特异性。实时荧光聚合酶链反应技术检测 HCV-RNA 是诊断HCV感染的有效方法。HCV 核心抗原检出时间早于抗-HCV，联合运用HCV-Ab 和HCV-Ag 或者HCV-Ab 和HCV-RNA 检测HCV，能显著降低 HCV-Ab检测所致的HCV感染的假阴性。但是，在广大的基层医院及CDC应用第三代ELISA 检测HCV-Ab、临床诊断HCV感染、或者应用于丙肝的疾病监测及其流行病学调查，现阶段仍具有重要地临床意义和社会意义。例如，EIAgen HCV Ab Kit 试剂的灵敏度为 100%，特异度达 99.53%；对于非HCV感染的病毒性肝炎、自身免疫性疾病及妊娠样本的特异性均为 100%。溶血、脂血样本等也对试剂的检测结果无影响。尤适用于阳性样本的筛选^[42]。

HCV感染“与HCV核心蛋白所致的特异性免疫反应密切相关，与组织树突状细胞功能受损、或者HCV病毒受体分子的异常表达也密切相关。”^[43]但其确切的感染机制尚未阐明。而且，有效的治疗性和预防性疫苗目前均尚未研制成功。继续深入地研究HCV感染机制，以期卓有成效地为预防和控制HCV感染、阻断HC的病变进程提供理论依据，提供切实有效的治疗靶点和新药研发途径，并为其临床实验研究拓展新的思路。研究有效预防HCV感染和抗病毒治疗的疫苗、药物及更加准确、可靠、便捷、经济的检测技术方法应是今后临床实验研究的重要任务。