水禽被认为是A型流感病毒的自然宿主^[1]。A型流感病毒包括16种HA和9种NA，2012年又在蝙蝠发现新的亚型H17N10^[2]。由于鸭在病毒传播 和演化过程中的重要角色，被称为H5N1的“特洛伊木马”^[3]。根据联合国粮农组织统计数据库(FAOSTAT)，全球75%的家鸭养殖都来自中国^[4]，中国家鸭传统的散养饲养方式在农村普遍存在。家鸭与野生水禽可以共享水源，可以导致禽流感病毒(AIV)的传播^[5]。同时，在农村或者养殖场家鸭可以与其他家禽、牲畜、人密接接触。因此家鸭在流感病毒生态学上起着非常重 要的作用^[6]。本研究 选择东洞庭湖湖区周边家鸭养殖户进行系统的禽流感监测，以了解其环境标本中禽流感病毒的分布情况。 1材料与方法 1.1标本采集

2011年11月至2012年4月在东洞庭湖周边的岳阳县、君山区的家鸭养殖户中连续每月采集环境标本(包括新鲜粪便标本和水标本)。养殖户/场纳入标准：①调查时养殖户/场中正有家鸭饲养；②养殖户/场附近有家鸭、野禽可能的共同饮用水源。现场调查前，由国家流感中心的专业人员对所有调查员进行培训，包括填写登记表、标签的使用、采集标本、处理标本、保存和运输标本原则等。每次调查分为2~4个小组，每个小组由1~2名质控员、多名调查员等组成。采集的粪便置于配有采样液的试管中。采样液配制参考世界卫生组织(WHO)动物流感病毒诊断和监测方案^[7]。水标本放置空管中。标本采集24 h内在4 ℃保存送至当地疾病预防控制中心(CDC)的网络实验室，保存于-70 ℃。按照国家生物安全相关规定进行标本运输。 1.2核酸检测和病毒分离

所有标本均取200 μl使用QIAamp One-For-All Nucleic Acid试剂盒(QIAGEN,German)通过德国QIAGEN公司的BioRobot Universal system仪器提取核酸，具体操作方法按照说明书完成。对提取的核酸使用AgPath-IDTM One-step RT-PCR KIT(AB,USA)利用针对甲型流感病毒M基因特异性的引物和探针在Mx3005P qPCR 仪(Stratagene，USA)上进行qPCR检测。核酸检测阳性(Ct值≤35)的原始标本用9～10日龄的SPF鸡胚，接种尿囊腔，每个标本接种两枚鸡胚，置35 ℃孵箱培养48 h后，4 ℃冰箱过夜。收集鸡胚尿囊液，用1%火鸡红细胞悬液进行血凝实验。对血凝阳性标本提取核酸后，使用国家流感中心设计的甲型流感病毒H1H16和N1N9的亚型特异性引物进行反转录-聚合酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的扩增，扩增产物通过凝胶电泳确定其亚型。 1.3数据分析

应用SPSS 17.0软件进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。 2结果

2.1标本采集情况

岳阳县和君山区的家鸭养殖户共101户，多为散养。2011年11月至2012年4月，共采集1202份标本，其中粪便标本739份，水样标本(包括禽类饮水、池塘水、河沟水、污水、稻田水等)463份，见表 1。

家鸭养殖户环境标本fluA总阳性率为5.32%，其中粪便标本、水标本(禽类饮水、池塘水、污水等)的fluA阳性率分别为5.01%、5.83%，二者差异无统计学意义。在重点采集的水标本中，禽类饮水、池塘水fluA阳性率分别为6.32%、4.12%，二者差异无统计学意义。不同的采样地区，君山区和岳阳县家鸭养殖户环境标本fluA阳性率分别为7.36%、3.02%，二者差异有统计学意义(χ²=11.16，P=0.001)。从表 2和图 1可以看出，每月平均采集200份标本，2012年3月fluA总阳性率最高，不同标本的fluA阳性率也最高。

图 1 不同标本的AIV阳性率时间分布 Figuer 1 Time distribution of positive detections of different samples

图选项

家鸭养殖户环境标本的病毒分离率为0.42%，分离到5株禽流感病毒，其中1株为H5N1，2株H4N2，2株为H3N6。1株H5N1来自岳阳县某养殖户3月采集的粪便标本。在该养殖户连续采样6个月，仅在2012年3月核酸检测fluA(100%)、H5(71%)阳性。2株H4N2来自君山区2家养殖户，均为家鸭的粪便标本。在一养殖户连续采样6个月，2011年12月、2012年1、3、4月(除2011年11月、2012年2月)均检出fluA阳性，2011年12月、2012年1月检测出H5阳性，但仅在4月的标本中分离出1株H4N2。另一养殖户为4月新增养殖户，1份粪便标本fluA阳性，分离出1株H4N2。2株H3N6来自君山区4月新增某养殖户的粪便标本。 3讨论

2013年2月人感染H7N9禽流感疫情，6月人感染H6N1，11月人感染H10N8，均为人感染该亚型的低致病性禽流感病毒的首次报告。其中人感染H7N9禽流感疫情，截止2014年5月已确诊430余例，死亡160余例，病死率36.67%。说明低致病性禽流感病毒对人类健康存在着极大威胁。因此，在家禽中流行的低致病性禽流感病毒不能被忽视。

洞庭湖湿地是中国最大的淡水湖泊湿地^[8]，为鸟类尤其是水禽类提供了良好的生存、越冬环境，尤其东洞庭湖是亚热带内陆湿地的典型代表^[9]，是中国冬候鸟和夏侯鸟迁徙时空的结合部，也是亚太迁徙线上鸟类的主要停歇地和越冬地。东洞庭湖鸟类物种繁多，近300种，水禽资源尤为丰富^[10]，在候鸟迁徙高峰期，栖鸟总量可达1000万只以上^[11]。资料显示，东洞庭湖周边县区的家禽存栏8000余万只^[12]。洞庭湖地区丰富的野禽和家禽数量，为进一步禽流感病毒的研究提供了有利条件。本项目调查发现，东洞庭湖地区家鸭多散养，且可以到附近的稻田觅食。同时，野禽也会被吸引到稻田去觅食，这就构成了洞庭湖湿地-稻田-鸭系统，资料显示这种系统会增加禽流感传播的风险^[13]。同时，本项目在纳入养殖户的条件之一即是与野禽可能有共同水源的养殖户，通过共同水源野禽-家鸭之间可能会传播禽流感病毒^[5]。

本研究中家鸭养殖户环境标本fluA总阳性率为5.32%，而H5(0.5%)、H9(0.5%)的阳性率都很低，可能存在其他禽流感病毒亚型。其中，水标本fluA阳性率(5.83%)与粪便标本阳性率(5.01%)差异无统计学意义。本项目采集的水标本为家鸭呆过或饮用过的水源，在不同类型的水标本中，值得注意的是，采集的水沟水标本数量较少，但其fluA阳性率为30%，建议可以进一步进行研究。

目前，在中国家鸭中曾分离到H4N2^{[5, 14]}、H5N5^[15]、H5N1^[16]、H3N2、H3N8、H4N6、H4N9、H5N1、H5N2、H6N6、H9N2、H10N3、H11N2、H11N9、H12N7^[17]和H7N3^[18]等多种亚型。本项目中除分离到H5N1、H4N2外，还分离到的H3N6，由此可说明家鸭可携带多种禽流感病毒。Deng等^[17]2011年11月和2012年3月在洞庭湖地区的家鸭养殖场采集泄殖腔拭子、气管拭子，同时采集养殖场的环境标本(粪便污染了的水和土壤)，较本项目分离到的病毒亚型多，其环境标本病毒分离率为2.3%，也高于本项目的病毒分离率，可能与采样标本种类有关。同时本项目的病毒分离率也低于活禽市场^[19]。活禽市场环境较差，家禽种类较多，除了鸡和鸭外，还有鹅、鸽子等其他禽类，有利于禽流感病毒的进化和种间传播^[20]。本项目分离到的H3N6为中国大陆首次在家鸭中分离到的禽流感病毒。文献显示，中国黑龙江的野禽中分离到H3N6；蒙古、日本、韩国、孟加拉国、克拉斯诺雅茨克(俄罗斯)、美国明尼苏达州、赞比亚在野禽或和家禽中曾分离到H3N6病毒^{[21, 22, 23, 24, 25, 26]}。结合相关数据，我们将进一步进行序列分析。

本项目针对东洞庭湖地区的家鸭养殖户的环境标本中禽流感病毒的分布进行研究，虽然仅分离到5株病毒，但是鉴于洞庭湖地区野禽、家禽的优越的地理条件，应在该地区常年开展AIV监测，以及时发现野禽-家禽之间的AIV传播机制，为AIV的有效防控提供依据。