川崎病(kawasaki disease，KD)又名皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种原因不明的儿童常见的自身免疫性血管炎综合征^[1]。KD的主要危险是心脏并发症，目前KD所致的冠状动脉并发症已取代风湿热成为儿童后天性心脏病的主要原因，并且可能成为成年人后缺血性心脏病的危险因素之—^[2]。对于KD的病因尚未完全清楚，可能与感染及异常免疫反应有关,有研究认为，免疫细胞激活并产生多种细胞因子及其介导的免疫反应在KD冠状动脉损伤中起了重要作用^3-4。有研究报道，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-γ、白介素1(IL-1)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、 IL-18、IL-21等细胞因子参与了KD的免疫损伤过程^{[5, 6, 7, 8, 9]}。IL-12(Interleukin-12，IL-12)是机体免疫调节及抗感染的关键细胞因子，国内外关于IL-12与KD免疫损伤及治疗相关性的报道甚少。IL-12是相对分子质量为70 ×10³的异源二聚体，主要由活化巨噬细胞和树突状细胞产生，是启动Th1反应的关键细胞因子，具有调节Thl/Th2间平衡及增强机体内细胞免疫应答的作用。IL-12由40 ×10³ (p40)和35 ×10³ (p35)两个亚基组成，其中p40亚基的表达只局限在巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞，对IL-12的表达水平具有决定性作用^[10]。本实验采用双抗体夹心 酶联免疫吸附试验(ELISA)，测定KD患儿血浆IL-12亚基p40水平，探讨其在KD的临床诊断、治疗及发病机制研究中的价值。 1 对象与方法 1.1 研究对象

KD组62例，为2010年1月至2013年12月于温州医科大学附属育英儿童医院就诊的住院患儿，均系汉族，年龄15日龄至11.2岁平均(1.6±2.0)岁，男性37例，女性25例，其中<5岁患儿53例(85.5%，53/62)。排除不愿意用静脉注射用丙种球蛋白患儿及近2周用过激素、静脉注射用丙种球蛋白、免疫抑制剂患儿。冠状动脉损伤(coronary artery lesions，CAIs)的判断标准为超声心动图发现冠状动脉内径至少3 mm(<5岁)/4 mm(>5岁)，或者冠状动脉某一节段内径至少是其相邻节段的1.5倍^[11]。上述KD患儿中，发生CALs有25例(40.3％，25/62)。全部患儿明确诊断后发病10天内给予单次剂量 静脉注射免疫球蛋白(IVIG)2000 mg/kg，同时口服阿司匹林治疗80 mg/(kg·d)，分3次服用。IVIG治疗后48 h症状不缓解，体温持续超过38 ℃，或者在治疗后的2～7 d症状再现(发热及至少1项KD症状)，即为IVIG不敏感性KD，否则为IVIG敏感性KD^[11]。本组患儿有23例(37.1％，23/62)符合IVIG不敏感的判断标准。对照组33名，为2010年1 12月于温州医科大学附属育英儿童医院儿童保健科就诊的健康体检儿童，均系汉族，年龄14日龄至12.5岁平均(1.5±1.8)岁，其中男性19人，女性14名，小于5岁的28名(84.8%，28/33)，无KD相关症状，未发生过自身免疫疾病。近3周内无感染性疾病，未用过激素、静脉注射用丙种球蛋白、免疫抑制剂。两组年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05)。 1.2 诊断标准

KD诊断标准参照2005年日本川崎病研究委员会第5次修订标准^[12]：①发热≥5 d；②双眼结膜充血(无渗出物)；③唇及口腔改变：口唇绛红、皲裂、杨梅舌、弥漫性充血；④皮肤改变：多形性红斑、皮疹；⑤肢体改变：(急性期)手掌、足底及指(趾)端潮红、硬肿，(恢复期)指趾端甲床及皮肤移行处膜样脱皮；⑥颈部非化脓性淋巴结肿大，单侧，直径>1.5 cm。上述症状符合5项以上者即可诊断。 1.3 实验方法 1.3.1 标本采集

所有KD患儿于入院后次日清晨空腹采集静脉血2～3 ml，以15%乙二胺四乙酸二钾 (EDTA-K₂) 抗凝，3000 r/min离心5 min，尽快分离血浆，于-40 ℃冰箱保存，用来检测IL-12p40、CRP、白蛋白水平。采集标本之前均未进行IVIG及阿司匹林治疗，未使用免疫调节剂。KD患儿使用IVIG及阿司匹林治疗2周后再次空腹采静脉血2～3 ml，分离血浆保存于-40 ℃待测。对照组均抽取清晨空腹血3 ml，尽快分离血浆，于-40 ℃冰箱保存备检。 1.3.2 血浆IL-12p40水平测定

采用双抗体夹心ELISA，测定对照组及KD患儿IVIG治疗前后血浆IL-12p40水平，试剂盒由南京厚载生物科技有限公司提供，严格按照说明书进行操作，在Anthos 2010型酶标仪(上海博赛思科技有限公司)上检测样本及标准品A值，通过绘制标准曲线求待测样本血浆IL-12p40水平。少部分标本A值高于标准曲线上限，用样本稀释液适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 1.3.3 血浆CRP、白蛋白检测

分别测定KD患儿急性期(IVIG治疗前)血浆CRP、白蛋白水平，CRP测定采用速率散射比浊法，在Beckman IMMAGE 800特定蛋白分析仪(美国Beckman coulter公司)上完成。白蛋白测定采用溴甲酚绿法，在Beckma lx20全自动生化分析仪(美国Beckman coulter公司)上完成。所用试剂及标准品均由Beckman coulter公司原装提供。 1.4 统计学方法

正态分布数据用x±s表示，组间比较采用t检验。非正态分布数据用中位数(M)、第5百分位数(P5)、第95百分位数(P95)表示，组间比较采用两独立样本的秩和检验。参数相关性采用单因素相关分析。以上统计学处理和分析均采用SPSS 17.0 软件包，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 KD组与对照组、CAIs组与非CAIs组血浆IL-12p40水平比较

由于样本呈偏态分布，血浆IL-12p40水平用中位数(M)、第5百分位数(P5)、第95百分位数(P95)表示，经两独立样本的秩和检验，KD组入院时(急性期)血浆IL-12p40水平明显高于正常对照组(Z=-2.821，P=0.006)，其中CAIs组血浆IL-12p40水平明显高于非CAIs组(Z=2.565，P=0.008)和对照组(Z=3.121，P<0.01)，非CAIs组血浆IL-12p40水平也高于对照组，差异有统计学意义(Z=2.053，P=0.044)。结果见表 1。

KD患儿急性期CRP水平为(37.63±31.45) mg/L，白蛋白水平为(32.94±2.20)g/L。经单因素相关分析，KD患儿急性期血浆IL-12p40水平与血浆CRP水平之间呈显著正相关(r=0.472，P<0.01)，与血浆Alb水平呈显著负相关(r=-0.421，P<0.01)。 2.3 不同疗效组治疗前后血浆IL-12p40水平变化

IVIG治疗前敏感组与不敏感组之间血浆IL-12p40水平差异无统计学意义(Z=1.523，P>0.05)。治疗2周后，IVIG敏感组血浆IL-12p40水平明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义 (Z=2.637，P=0.007<0.01)，而IVIG不敏感组治疗前后血浆IL-12p40水平差异无统计学意义(Z=1.685，P=0.137>0.05)。结果见表 2。

KD病因及发病机制迄今尚未完全阐明，多数学者认为本病与感染介导的免疫系统高度活化密切相关^{[3, 4]}。有研究表明，在KD发病过程中，T细胞异常活化是导致血管免疫损伤的始动环节和关键步骤，活化的免疫活性细胞可分泌大量的炎性介质参与KD病理发展过程，包括多种细胞因子、黏附分子和趋化分子，可直接损伤血管内皮并导致血管壁免疫炎性损伤，同时过度炎性反应性纤维增生又是导致血管内膜增厚、管腔狭窄的病理基础^{[13, 14]}。这些细胞因子、免疫活性分子既是活化免疫细胞产物，反过来又作用于免疫活性细胞，进一步放大免疫效应，细胞因子在血循环中呈级联放大效应是血管炎性损伤的基础^[3]。有研究报道，IL-8、IL-17和TNF-α在KD患儿免疫损伤性血管炎的病理生理发生机制中起重要作用，对预测冠状动脉损伤有重要临床意义^[6]。张本山等^[7]报道IL-10、IL-18可作为反应在KD的炎症指标，并在提示冠脉损伤方面有一定的临床价值。温泉等^[8]报道IFN-γ、IL-4、IL-10可能通过调节T细胞活化的细胞因子机制参与KD发病的自身免疫耐受过程。李晓霞等^[9]报道KD急性期血清IL-21水平与血沉、免疫球蛋白A、冠状动脉扩张程度之间存在正相关。IL-12又名自然杀伤细胞刺激因子(nature killer stimulating factor，NKSF)、细胞毒性淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF)，主要由活化的炎性细胞产生，是Th1细胞免疫应答的决定因素。国内外关于IL-12与KD免疫损伤及治疗相关性的报道甚少，本研究结果显示，KD患儿急性期血浆IL-12p40水平明显高于正常儿童，CAIs组血浆IL-12p40水平明显高于非CAIs组，表明IL-12参与了KD及其CAIs的发生过程，在KD急性发作时，IL-12合成分泌增多，由于IL-12能够促进CD4⁺ T细胞向着Th1过度分化、抑制Th2分化，使Th1/Th2比例失衡^[15]。其中Thl细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等促炎介质，这些细胞因子既可以直接损伤血管内皮细胞，也可以刺激其他炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞分泌炎性介质，放大炎性反应；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、lL-10等抗炎介质，但其分泌过度也会导致炎症失控，造成抗炎反应综合征。正常情况下，两类细胞因子处于动态平衡，共同维持机体正常的免疫反应，一旦这种平衡被打破，出现Thl/Th2细胞因子失衡，将导致免疫损伤，因此lL-12很可能通过使Thl/Th2比例失衡、进而引发下游炎症释放级联反应参与了KD患儿血管炎性损伤的发生过程。本文结果还显示，KD患儿急性期的IL-12p40水平与反映KD疾病活动性的实验室指标CRP呈正相关，与白蛋白呈负相关，进一步表明IL-12参与了KD的发病过程，而且与病情的严重程度关系密切，测定KD患儿血浆IL-12p40水平或可作为衡量病情严重程度的指标之一。

IVIG治疗是目前治疗KD的首选方法，但仍有10％左右的患儿对IVIG治疗无反应^[16]。IVIG治疗KD的可能机制为：调节免疫细胞活化，抑制细胞因子产生，竞争性阻断抗原提呈细胞的Fc受体，抑制补体系统介导的免疫血管损伤，中和引起KD的病原体或毒素超抗原等。本研究发现，IVIG治疗前，敏感组与不敏感组之间血浆IL-12p40水平差异无统计学意义，但治疗2周后，IVIG敏感组血浆IL-12p40水平明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义，而IVIG不敏感组治疗前后血浆IL-12p40水平差异无统计学意义。提示KD患儿血浆IL-12p40水平在预测IVIG治疗效果方面意义不大，但其水平变化与IVIG治疗敏感性关系密切，或可作为判断药物疗效的指标。临床上对于KD的治疗采取积极抗炎、抗凝、IVIG等治疗外，早期适当阻断IL-12分泌，或可作为治疗的辅助手段之一。

总之，血浆IL-12p40水平和KD的发生、临床病情以及治疗效果都有着较为密切的关系，其水平变化在一定程度上可反应疾病的严重程度，并对预测是否并发冠状动脉病变以及IVIG治疗效果评价有一定价值，为今后KD的诊治提供了新的方向。