多耐鲍曼不动杆菌分子流行病学分析

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谭红丽, 程雪琴, 王勇, 黄艳梅, 刘炜, 张丽娟

TAN Hong-li, CHENG Xue-qin, WANG Yong, HUANG Yan-mei, LIU Wei, ZHANG Li-juan

多耐鲍曼不动杆菌分子流行病学分析

Molecular characterization of multi-drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients in a hospital in Yunnan

疾病监测, 2015, 30(1): 8-13

Disease Surveillance, 2015, 30(1): 8-13

10.3784/j.issn.1003-9961.2015.01.004

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收稿日期：2014-07-25

引用本文

谭红丽, 程雪琴, 王勇, 黄艳梅, 刘炜, 张丽娟. 多耐鲍曼不动杆菌分子流行病学分析[J]. 疾病监测, 2015, 30(1): 8-13. 复制到剪切板

TAN Hong-li, CHENG Xue-qin, WANG Yong, HUANG Yan-mei, LIU Wei, ZHANG Li-juan. Molecular characterization of multi-drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients in a hospital in Yunnan[J]. Disease Surveillance, 2015, 30(1): 8-13. 复制到剪切板

多耐鲍曼不动杆菌分子流行病学分析

谭红丽¹, 程雪琴², 王勇^{2, 3}, 黄艳梅¹, 刘炜², 张丽娟²

1. 云南省第三人民医院, 云南昆明 650011;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 102206;
3. 新疆石河子大学, 新疆石河子 832003

收稿日期:2014-07-25

基金项目：国家"十二五"传染病重大专项课题(No.2008ZX10004-008、2012ZX10004215);国家"973"基础研究项目(No.2010CB530206).

作者简介: 谭红丽, 女, 本科, 副主任技师, 主要从事临床检验工作;程雪琴, 女, 硕士, 主要从事立克次体病监测及研究;王勇, 男, 博士, 主要从事人兽共患病研究

通信作者：张丽娟, Tel:010-58900781, Email:zhanglijuan@icdc.cn

摘要：目的分析云南省第三人民医院鲍曼不动杆菌分离株耐药表型及耐药基因分子流行病学特征. 方法 2013年6-9月,分离该院不同重症监护室(ICU)院内感染患者鲍曼不动杆菌28株,全自动微生物分析仪分类鉴定及耐药分析.PCR扩增及测序β-内酰胺酶、氟喹诺酮类及氨基糖苷类等抗性基因及IS插入元件及整合子等. 结果 78.6%菌株为多药耐药菌,14.3%菌株为广泛耐药菌,7.1%的菌株为泛耐药菌. 100%菌株不仅对一代/二代头孢类抗生素耐药,且对三代/四代抗生素CRO、CAZ、 FEP及单环β-内酰胺类(ATM)、氟喹诺酮类(CIP、LEV)、氨基糖苷类(AN)及磺胺类(FD)耐药.特别是92.9%菌株对碳青霉烯类抗生素耐药.质粒介导的D类β-内酰胺类抗性基因bla_OXA、氟喹诺酮类[aac(6')-Ib-cr、qnrA及qnrD]及氨基糖苷类(aacA4、 aadA1及 aacC2)为主要基因型.100%菌株复合携带bla_OXA、aac(6')-Ib-cr及aacA4等抗性基因及整合酶int1基因.85.7%菌株携带ISCR1.全部菌株为同一脉冲场凝胶电泳(PFGE)克隆群,且多位点序列分型(MLST)优势基因型为ST2. 结论云南昆明第三人民医院ICU病房可能存在ST2多耐产碳青霉烯酶A. baumanni院内感染流行,有必要进行进一步流行病学及临床深入调查.防控措施及合理使用抗生素是当地医院当务之急.

关键词：鲍曼不动杆菌多重耐药耐药基因分子流行病学

Molecular characterization of multi-drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients in a hospital in Yunnan

TAN Hong-li¹, CHENG Xue-qin², WANG Yong^2,3, HUANG Yan-mei¹, LIU Wei², ZHANG Li-juan²

1. Department of Clinical Microbiology Laboratory, the Third People's Hospital of Yunnan Province, Kunming 650011, Yunnan, China;
2. Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
3. College of Animal Science & Technology, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang, China

Abstract:Objective To analyze phenotypes and genotypes of Acinetobacter baumannii isolated from ICU patients in a hospital in Kunming, Yunnan province. Methods A total of 28 A. baumannii strains were isolated from the patients in this hospital, and the strains were identified and their susceptibilities to 21 antibiotics were tested by using the bioMe'rieux VITEK-2 system. PCR screening and sequencing was performed to identify β-lactamase genes, fluoroquinolone resistance related genes, aminoglycoside resistance related genes and gene capturing elements. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST) were conducted to analyze the genetic relationships among the isolates. Results Among the strains isolated, 78.6% were MDR, 14.3% were XDR and 7.1% were PDR. All the isolates were resistant not only to 1^st and 2^nd generation cephalosporins and most 3^rd and 4^th generation cephalosporins (ceftriaxone, ceftazidime and cefepime), but also to monobactams (aztreonam), quinolones (ciprofloxacin and levofloxacin), aminoglycosides (kanamycin) and nitrofurantoin (furadantin). All the isolates co-carried bla_OXA genes, quinolone resistance related gene-aac(6')-Ib-cr, aminoglycosides resistance related gene-aacA4 and gene capturing element-int 1. Phylogenetic analyses by PFGE revealed that all the isolates were in one clad. Conclusion MDR A. baumannii possessing bla_OXA, aac(6')-Ib-cr, and aacA4 might circulate in this hospital, it is necessary to conduct further clinical and epidemiological survey, take effective control measures and use antibiotics rationally.

Key words: A. baumannii Multi-drug resistance Resistance related gene molecular epidemiological characteristics

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)院内感染是当前全球范围内面临的巨大挑战。该菌的耐药尤其是多耐、泛耐菌株的出现与快速播散给临床治疗带来极大困难^[1]。2000年以来，云南省第三人民医院检验科发现，多重耐药鲍曼不动杆菌分离率不断增加。临床及流行病学调查发现，菌株分离患者均符合院内感染(health care-associated,HA)标准^[2]。为分析该菌分子流行病学特征、预防控制院内感染暴发流行，中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所与云南省第三人民医院合作进行了鲍曼不动杆菌耐药表型及耐药基因分子流行病学分析。

1 材料与方法 1.1 菌株

2013年69月，云南省第三人民医院入住重症监护室(ICU)48 h后院内感染患者分离的鲍曼不动杆菌28株。其中，22株分离于痰标本、4株来自尿标本、2株来自分泌物。平均年龄70.4岁(27.0～93.0岁)。男女性别比为6∶1(24/4)。患者均来自全省范围内到昆明就诊住院患者。

1.2 菌株鉴定及药物敏感性鉴定

法国梅里埃全自动微生物分析仪(bioMerieux VITEK-2 system)进行菌株鉴定及药物敏感分析。细菌鉴定卡及药敏卡均为法国梅里埃公司提供。菌种鉴定进一步采用原核细菌16 SrRNA基因扩增及测序分析完成^[3]。多耐菌(multi-drug-resistant,MDR)、广泛耐药菌(extensively drug-resistant,XDR)及泛耐药菌(pandrug-resistant,PDR)等按国际标准分类^[4]。

1.3 耐药基因分子流行病学分析

聚合酶链反应(PCR)扩增包括超广谱β-内酰胺酶bla基因、氟喹诺酮类及氨基糖苷类抗生素耐药基因、IS插入元件及整合子等。扩增引物及反应条件见表 1参考文献。引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。细菌质粒提取用百泰克生物技术有限公司试剂盒(Cat No.DP1002)。DNA提取用德国 QIAGEN试剂(Cat No. 69506)。PCR产物送北京擎科生物技术有限公司双向测序，采用NCBI网站Blast平台进行序列同源比较。

表1 PCR扩增耐药基因及基因捕获元件等所需引物信息 Table 1 Primers used in amplification for resistance related genes and gene capturing elements

目标基因	引物名称	引物序列(5′~3′)	片段大小(bp)	参考文献
β-内酰胺类
TEM	TEM-F	TCC GCT CAT GAG ACA ATA ACC	931	^[5]
	TEM-R	TTG GTC TGA CAG TTA CCA ATG C
SHV	SHV-F	TGG TTA TGC GTT ATA TTC GCC	868	^[5]
	SHV-R	GGT TAG CGT TGC CAG TGC T
CTX-M	CTX-F	TCT TCC AGA ATA AGG AAT CCC	909	^[5]
	CTX-R	CCG TTT CCG CTA TTA CAA AC
VEB	VEB-F1	GAT AGG AGT ACA GAC ATA TG	914	^[5]
	VEB-R1	TTT ATT CAA ATA GTA ATT CCA CG
PER	PER-F	ATG AAT GTC ATC ACA AAA TG	927	^[5]
	PER-R	TCA ATC CGG ACT CAC T
GES	GES-F	ATG CGC TTC ATT CAC GCA C	864	^[5]
	GES-R	CTA TTT GTC CGT GCT CAG G
KPC	KPC-F	ATG TCA CTG TAT CGC CGT CT	882	^[6]
	KPC-R	TTT TCA GAG CCT TAC TGC
NDM	NDM-F	GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC	621	^[6]
	NDM-R	CGG AAT GGC TCA TCA CGA
IMP	IMP-F	GGA ATA GAG TGG CTT AAT TCT C	624	^[6]
	IMP-R	CCA AAC CAC TAC GTT ATC
VIM	VIM-F	GGT CTC ATT GTC CGT GAT GGT GAT GAG	271	^[6]
	VIM-R	CTC GAT GAG AGT CCT TCT AGA G
CMY	CMY-F	TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA	462	^[6]
	CMY-R	TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC
DHA	DHA-F	AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T	405	^[6]
	DHA-R	CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC
FOX	FOX-F	AAC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G	190	^[6]
	FOX-R	CAA AGC GCG TAA CCG GAT TGG
OXA	OXA-2-F	AAG AAA CGC TAC TCG CCT GC	478	^[5]
	OXA-2-R	CCA CTC AAC CCA TCC TAC CC
	OXA-10-F	GTC TTT CGA GTA CGG CAT TA	720	^[5]
	OXA-10-R	ATT TTC TTA GCG GCA ACT TAC
	OXA-23-F	GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA		^[7]
	OXA-23-R	ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT
	OXA-24-F	GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA		^[7]
	OXA-24-R	AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT
	OXA-51-F	TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG		^[7]
	OXA-51-R	TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG
	OXA-48-F	TTG GTG GCA TCG ATT ATC GG	743	^[7]
	OXA-48-R	GAG CAC TTC TTT TGT GAT GGC
	OXA-58-F	AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG		^[7]
	OXA-58-R	CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC
氟喹诺酮类
qnrA	qnrA-F	ATT TCT CAC GCC AGG ATT TG	627	^[6]
	qnrA-R	GAT CGG CAA AGG TTA GGT CA
qnrB	qnrB-F	GAT CGT GAA AGC CAG AAA GG	469	^[6]
	qnrB-R	ACG ATG CCT GGT AGT TGT CC
qnrC	qnrC-F	GGG TTG TAC ATT TAT TGA ATC G	307	^[6]
	qnrC-R	CAC CTA CCC ATT TAT TTT CA
qnrD	qnrD-F	CGA GAT CAA TTTA CGG GGA ATA	533	^[6]
	qnrD-R	AAC AAG CTG AAG CGC CTG 533
qnrS	qnrS-F	ACG ACA TTC GTC AAC TGC AA	417	^[6]
	qnrS-R	TAA ATT GGC ACC CTG TAG GC
aac(6′) -Ib-cr	aac(6′) -Ib-cr -F	TTG CGA TGC TCT ATG AGT GGC TA	482	^[6]
	aac(6′) -Ib-cr -R	CTC GAA TGC CTG GCG TGT TT
qepA	qepA-F	AAC TGC TTG AGC CCG TAG AT	596	^[6]
	qepA-R	GTC TAC GCC ATG GAC CTC AC
gyrA突变	gyrA-F	CGA CCT TGC GAG AGA AAT	626	^[6]
	gyrA-R	GTT CCA TCA GCC CTT CAA
氨基糖苷类
aacA4	aacA4-F	ATG ACT GAG CAT GAC CTT GCG	540	^[6]
	aacA4-R	TTA GGC ATC ACT GCG TGT TCG
aacC1	aacC1-F	ATG GGC ATC ATT CGC ACA TGT AGG	873	^[6]
	aacC1-R	TTA GGT GGC GGT ACT TGG GTC
aacC2	aacC2-F	ATG CAT ACG CGG AAG GCA ATA AC	861	^[6]
	aacC2-R	CTA ACC GGA AGG CTC GCA AG
aadA1	aadA1-F	ATG AGG GAA GCG GTG ATC G	792	^[6]
	aadA1-R	TTA TTT GCC GAC TAC CTT GGT G
aadB	aadB-F	ATG GAC ACA ACG CAG GTC GC	534	^[6]
	aadB-R	TTA GGC CGC ATA TCG CGA CC
aphA6	aphA6-F	ATG GAA TTG CCC AAT ATT ATT C	781	^[6]
	aphA6-R	TCA ATT CAA TTC ATC AAG TTT TA
插入元件/整合子
int1	int 1F	CCT CCC GCA CGA TGA TC	280	^[8]
	int 1R	TCC ACG CAT CGT CAG GC
ISCR1	CR1F	ATG TCT CTG GCA AGG AAC GC	1450	^[8]
	CR1R	AGA CGA CTC TGT GAT GGA TC
ISEcp1	IS-F	GTG CCC AAG GGG AGT GTA TG	615	^[5]
	IS-R	ACY TTA CTG GTR CTG CAC AT

表选项

1.4 多位点序列分型(MLST )和脉冲场凝胶电泳(PFGE)

为分析遗传变异关系，试验菌株进行了MLST及PFGE分型。MLST引物、操作及MLST 序列型(STs)分析见www.pasteur.fr/mlst网站。MLST分型使用7个基因包括cpn60、fusA、gltA、pyrG、recA、rplB、rpoB。PFGE采用CHEF Mapper XA脉冲场电泳仪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)按参考方法进行^[9]，PFGE带型分析使用Fingerprinting Ⅱ软件(version 3.0,Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，相似性大于80%归为一簇。

1.5 统计学分析

应用SPSS 软件(version 9.1,SAS Institute,Inc.,Cary,NC) 进行统计分析。变量间比较用χ²检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 耐药分析

细菌耐药结果见表 2。本次检测的鲍曼不动杆菌按耐药分类标准，78.6%(22/28)菌株为MDR，14.3%(4/28)菌株为广泛耐药菌(XDR)，7.1%为泛耐药菌(PDR)。100%菌株不仅对一代/二代头孢类抗生素耐药，且对三代/四代抗生素CRO、CAZ、 FEP及单环β-内酰胺类(ATM)、氟喹诺酮类(CIP、LEV)、氨基糖苷类(AN)及磺胺类(FD)等耐药。值得注意的是92.9%菌株对碳青霉烯类抗生素耐药。

表2 实验菌株药物敏感性试验结果 Table 2 Antibiotic susceptibility test results for strains isolated

注:(1)S:敏感菌株； I：中介耐药菌株； R：耐药菌株。
分类	抗生素名称	细菌耐药及敏感率(%)⁽¹⁾
分类	抗生素名称	S	I	R
氨苄西林	AMP	0.0	0.0	100.0
羧苄青霉素+ β-内酰胺抑制剂	TZP	0.0	7.1	92.9
青霉素+β-内酰胺抑制剂	SAM	7.1	50.0	42.9
一代/二代头孢霉素	CXM	0.0	0.0	100.0
	CFZ	0.0	0.0	100.0
三代/四代头孢霉素	CRO	0.0	0.0	100.0
	CAZ	0.0	0.0	100.0
	SCF	35.7	57.1	7.1
	FEP	0.0	0.0	100.0
头孢霉素	CTT	0.0	14.3	85.7
碳青霉烯类	ETP	7.1	0.0	92.9
	MEM	7.1	0.0	92.9
	IMP	7.1	0.0	92.9
单环β-内酰胺类	ATM	0.0	0.0	100.0
氟喹诺酮类	CIP	0.0	0.0	100.0
	LEV	0.0	0.0	100.0
氨基糖苷类	GM	7.1	0.0	92.9
	TM	7.1	14.3	78.6
	AN	0.0	0.0	100.0
叶酸代谢途径抑制剂	SXT	14.3	0.0	85.7
磺胺类	FD	0.0	0.0	100.0

表选项

2.2 耐药基因型

以质粒及基因组DNA模板，PCR扩增及序列分析显示，除了bla_OXA 基因外，其他β-内酰胺类耐药基因(表 2)均为阴性。在质粒介导的bla_OXA 阳性菌株中，64.3%(18/28)菌株为复合携带bla_{OXA-2/23/48/51/58}基因。7.1%(2/28) 菌株携带bla _{OXA-2 /-48/-51/-58}基因,7.1%(2/28) 菌株携带bla_{OXA-2 /-23/-48/-51}基因,7.1%(2/28) 菌株携带bla _{OXA-2 /-23/-51}基因。14.3%(4/28) 菌株单一携带bla_OXA-51基因。7种氟喹诺酮类抗性基因检测发现，100%菌株携带 aac(6’)-Ib-cr,85.7%菌株携带qnrA，78.6%菌株携带 qnrD。其他4种基因包括qnrB、qnrC、qnrS和qepA没有检测到，也没有检测到gyrA突变。6种氨基糖苷类抗性基因检测发现，100%菌株携带aacA4，85.7%菌株携带aadA1，7.1%菌株携带aacC2，没有检测到aacC1、aadB 和aphA6。移动元件及整合子检测发现100%菌株携带int1，85.7%菌株携带ISCR1。没有检测到ISEcp1。

2.3 MLST及PFGE分型特征

使用7个保守基因包括cpn60、fusA、gltA、pyrG、recA、rplB、rpoB 进行MLST分型，结果提示，同欧洲地区流行株分布极为相似，ST2为优势序列型，占85.7%。与GenBank收录的12个全基因组比较并进化分析，结果本试验菌株与我国天津鲍曼不动杆菌MDR-TJ关系密切^[10]。此外还检测到ST5及ST6，分别占7.1%。PFGE结果显示所有分型成功菌株按聚类分析标准(>80%相似性为一群)为同一克隆群，见图 1。

图 1 代表性菌株PFGE聚类分析 Fig. 1 PFGE pattern and drug-resistant genotype of isolates

图选项

3 讨论

多耐鲍曼不动杆菌院内感染暴发已经成为当今世界重大的公共卫生问题，尤其是临床ICU重症患者感染后病死率高达30%^[11]。本研究实验菌株来自同一医院不同ICU病房，均符合院内感染标准并证实全部菌株呈现多重耐药，尤其是92.9%菌株对3种试验碳青霉烯类抗生素全部耐药。除MDR菌株(78.6%)外，还出现了XDR(14.3%)及PDR(7.1%)菌株。特别值得注意的是这些不同ICU病房的高度耐药菌株遗传进化关系属于同一PFGE克隆群(图 1)，提示当地医院可能存在有碳青霉烯酶多耐鲍曼不动杆菌院内感染流行，有待深入流行学及临床调查。ST2序列型为欧洲地区主要流行株，在意大利、希腊频繁暴发院内感染事件^[12,13]，近年在亚洲中东地区及北非地区也时有报道^[14,15,16]。这一分子流行病学结果进一步为临床院内感染提供了分子遗传学证据。流行株耐药基因主要包括质粒介导的D类β-内酰胺类抗性基因-OXA、氟喹诺酮类[aac(6’)-Ib-cr、 qnrA 及qnrD]以及氨基糖苷类(aacA4、 aadA1及 aacC2)。D类β-内酰胺类抗性基因是近年发现并呈全球分布，该类基因不仅水解广谱头孢菌素，而且与碳青霉烯类抗生素抗性密切相关。最新研究证实，世界范围内有8群bla_OXA基因^[17]。本研究全部菌株携带该类基因，并表现高度复合携带状态(图 1)。100%菌株携带bla_OXA-51，85.7%菌株复合携带多种bla_OXA基因，bla_{OXA-2/23/48/51/58}复合携带菌株占64.3%。除了世界范围内广泛分布的bla_OXA-23^[1]，78.6%菌株还检测到最新发现的bla_OXA-48基因。我国流行株主要携带bla_OXA-23基因 ^[18,19,20]，近年bla_OXA-51和bla_OXA-58也屡见报道^[21,22]，并且存在bla_OXA-23 和其他bla_OXA基因复合携带状况^[21,23,24]。本试验菌株不仅复合携带多种bla_OXA基因，而且大多数菌株还复合携带氟喹诺酮类及氨基糖苷类多种基因。

本试验100%菌株携带整合酶基因int 1，85.7%菌株携带ISCR1。这一分子遗传学结果与耐药表型高度一致，也进一步提示当地细菌多重耐药及快速传播扩散与这些基因捕获元件密切相关^[25]。 ISEcp1插入元件位于bla_CTX-M基因上游，发挥启动子作用。本试验没有检测到bla_CTX-M基因及相关的ISEcp1插入元件。

本研究结果提示当地医院ST2型多重耐药产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌正在流行，对ICU重症患者治疗构成严重威胁，进一步开展详细的流行病学调查和采取必要的防控措施及合理应用抗生素是当务之急。

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