手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是一种由多种人肠道病毒感染引起的儿童常见传染病,目前研究发现，可以引起手足口病的肠道病毒有20多种，其中以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)最为常见，且重症病例多由EV71引起^[1]。2008年5月我国卫生部将其纳入法定报告管理的丙类传染病。手足口病因其传播途径多样、传染性强、传播快的特点，且为托幼儿童高发，故常在托幼机构与学校发生聚集性感染甚至暴发流行。家庭成员间直接接触或间接接触肠道病毒污染的物品均有可能造成肠道病毒的传播,而成年人与儿童之间的传播机制如何，目前未有相关文献报道^[2]。本研究对EV71感染手足口病患儿的肠道排毒时间及传播机制进行初步探讨。

2013年58月杭州市儿童医院手足口病病区收治的临床疑似手足口病，经采集咽拭子或粪便标本并用 实时荧光定量反转录-聚合酶链反应 (real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,real time RT-PCR) 方法进行核酸病毒检测,确诊65例EV71感染者。65例患儿中，男36例，女29例，男女性别比1.24∶1；发病年龄1.92(1.25~3.46)岁，根据我国卫生部颁布的《手足口病诊疗指南(2010)》的诊断标准进行临床分类：普通型25例(38.5%)，重症40例(61.5%)。

调查58名EV71核酸阳性患儿发病后1周内(急性期)有密切接触史家属(每患儿2位)共116人，均取得家属知情同意。80人采集粪便标本，36人采集咽拭子。

采集手足口病病区医务人员(工作3个月至3年)粪便标本31人，其中医生10人，护士21人。

对65例EV71感染手足口病患儿进行追踪和随访，随访主要通过患儿定期返院检查的方式进行。自患儿发病之日起，每隔4~7 天收集1次粪便标本，粪便标本采集量为5～8 g/份，标本采集后放入无菌采便管内。有接触史家属和手足口病病区医务人员采集粪便5～8 g/份，标本采集后放入无菌采便管内。36名接触史家属咽拭子样本，用专用采集棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，迅速将棉签放入装有3~5 ml保存液的采样管中。所有标本采集后即送实验室，－20 ℃以下冷冻保藏，均在48 h内完成实验室检测工作。EV71感染患儿直至患儿粪便EV71核酸检测转阴为止。

采用江苏硕世生物科技有限公司生产的RNA提取试剂盒提取上述咽拭子或粪便标本中的RNA。提取的RNA溶于50 μl TE缓冲液中。采用广州中山大学达安基因股份有限公司生产的通用型肠道病毒RNA检测试剂盒及EV71 real time RT-PCR试剂盒检测上述标本中的病毒RNA。

根据试剂盒说明书进行反应混合液的配制和循环参数的设置。热循环参数为40 ℃预热 25 min，1个循环；94 ℃预变性3 min，1个循环；之后进入扩增程序，93 ℃ 变性15 s，55 ℃退火延伸45 s，共进行40个循环。单点荧光检测选择在55 ℃，荧光通道选择在FAM通道。设置完成后，保存文件，运行程序。

采用SPSS 16.0软件进行统计处理。计量资料用均数及标准差表示，计数资料用构成比及率表示。两组间计量资料的比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

普通型组患儿病愈出院的时间是病程的1周内(5～7 d)。重症组患儿病愈出院的时间是病程的2周内(7~12 d)。 25例EV71普通型组患儿在随访过程中，第1~6周EV71普通型组患儿的粪便病毒核酸阳性率分别为100%、88.4%、59.4%、22.3%、22.3%、0。40例EV71重症组患儿在随访过程中，第1～10周EV71重症组患儿的粪便病毒核酸阳性率分别为100%、97.0%、79.5%、60.6%、35.3%、25.2%、16.8%、16.8%、8.4%、0。随着时间的延长，两组患儿的粪便病毒核酸阳性率均呈下降趋势。EV71在普通型手足口病患儿粪便中持续最长时间为6周；EV71在重症手足口病患儿粪便中持续最长时间为10周。两组手足口病患儿的粪便病毒核酸阳性率的分布差异有统计学意义(χ²=5.689，P=0.017)，见图 1。

图 1 EV71普通型与重症手足口病患儿在不同随访时间的粪便病毒阳性率 Figure 1 EV71 positive rates of stool samples during follow up in mild and severe HFMD cases

图选项

40例重症病例中EV71病毒载量拷贝数>10³／ml者32例(80.7%)，最高病毒载量拷贝数达1×10⁸；在普通型病例中>10³／ml者17例(68.0%)，最高病毒载量拷贝数达1×10⁸。对两组病毒载量取对数做t检验，两组患儿的病毒载量差异无统计学意义(P=0.794)，见表 1。

31名医务人员粪便EV71及Cox A16核酸均阴性；36名采集咽拭子的患儿密切接触者中，除1例EV71核酸阳性其余均为阴性，阳性者无自觉症状；80名采集粪便标本的患儿密切接触者中，EV71核酸阳性22例，占27.5%，其中5名患儿家属2名同时阳性；均未检出Cox A16核酸。

近半个世纪手足口病在全球范围内已发生过数次大规模暴发流行，规律为每隔2～3年流行1次，EV71和Cox A16作为主要病原体交替出现或者共同流行^[3]。EV71型感染预防控制策略的重心应主要着眼于传染源的控制和切断传播途径。手足口病主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途经传播，易感者可通过直接接触隐性感染者或患者的唾液、疱疹液、粪便或痰液鼻涕等感染，也可通过间接接触患者使用过的物品而感染。患者、隐性感染者为该病流行的主要传染源，而隐性感染者作为传染源的意义可能更大。有研究指出^[4]人是肠道病毒的唯一自然宿主，患者与隐性感染者均为传染源且隐性感染者与患者的比例为100∶1，散发期隐性感染者为主要传染源，流行期隐性感染者和患者同为主要传染源，提示手足口病隐性感染者应是手足口病传播链上的关键环节。

我国《手足口病预防控制指南(2009版)》中要求手足口病患儿管理时限为自患儿被发现起至症状消失后1周。本研究结果表明，普通型病例中第3周粪便病毒核酸阳性率62.6%，第4周23.5%，粪便中病毒阳性持续时间最长为6周;而重症病例第四周粪便病毒核酸阳性率达62.4%，第6周26.0%，最长达10周。何义林等^[5] 报道EV71感染患儿随访的第1～6周，粪便病毒核酸阳性率分别为81.3%、60.9%、47.4%、 33.9%、 27.1%、18.1%。可见按目前手足口病的防控措施，EV71感染手足口病患儿恢复期仍携带病毒，为手足口病流行和传播的重要因素，特别是重症手足口病。学校、 幼托机构和家庭等是手足口病聚集病例的高发场所。有人对广州市幼儿家庭进行流行病学调查、 多因素分析结果显示儿童饭前便后洗手、 独立使用勺子进食、 粪便自理是手足口病家庭聚集性感染的保护因素。但无症状手足口病例在学龄前儿童传播中的作用仍然未知，病毒载量及其在学龄前儿童疾病传播中的具体作用仍然未知^[6]。故EV71感染手足口病患儿何时复学，是手足口病预防控制的研究重要课题。

邓爱萍等^[7]在成年人粪便标本中未检出EV71和Cox A16，提示健康成年人隐性感染EV71和Cox A16的可能性低。20012002年，中国台湾地区开展了一项关于EV71家庭接触感染的研究，采用家庭队列研究的方法，对儿童医院手足口病住院患儿及其家庭成员进行临床评价、病原学研究及问卷调查并随访半年，结论为94个家庭(433名家庭成员)中至少有1名家庭成员获得EV71感染，EV71家庭接触传播率是52％^[8]。日本2006年关于1名37岁母亲在3名儿子陆续罹患手足口病 3 天后发生急性EV71脑炎的报道，Hamaguchi等^[9]在对4株EV71毒株遗传分析后提出了家庭EV71传播且为儿童传播成年人的可能。成年人多由隐性感染获得免疫力，不易发生手足口病，但成年人获得肠道病毒感染期间却可能因为密切接触等原因造成儿童手足口病的发生。对EV71感染手足口病患儿有接触史家庭成员的调查发现，粪便中EV71阳性占27.5%，咽部阳性仅占2.8%，阳性者无临床症状。故手足口病患儿家庭成员，特别是密切接触者，易成为隐性感染者，易造成手足口病传播。手足口病病区医护人员是手足口病患儿的长期密切接触人员，是手足口病传播风险的人群，但病区医务人员粪便标本均未检出EV71和Cox A16，提示虽然手足口病病区医务人员长期接触手足口病患儿，但EV71和Cox A16隐性感染的可能性低，与医务人员既往感染体内已产生抗体或预防控制意识强有关，因此不容易感染EV71和Cox A16，作为隐性感染者传播意义不大。

邓爱萍等^[7]在成年人粪便标本中未检出EV71和Cox A16，提示健康成年人隐性感染EV71和Cox A16的可能性低。20012002年，中国台湾地区开展了一项关于EV71家庭接触感染的研究，采用家庭队列研究的方法，对儿童医院手足口病住院患儿及其家庭成员进行临床评价、病原学研究及问卷调查并随访半年，结论为94个家庭(433名家庭成员)中至少有1名家庭成员获得EV71感染，EV71家庭接触传播率是52％^[8]。日本2006年关于1名37岁母亲在3名儿子陆续罹患手足口病 3 天后发生急性EV71脑炎的报道，Hamaguchi等^[9]在对4株EV71毒株遗传分析后提出了家庭EV71传播且为儿童传播成年人的可能。成年人多由隐性感染获得免疫力，不易发生手足口病，但成年人获得肠道病毒感染期间却可能因为密切接触等原因造成儿童手足口病的发生。对EV71感染手足口病患儿有接触史家庭成员的调查发现，粪便中EV71阳性占27.5%，咽部阳性仅占2.8%，阳性者无临床症状。故手足口病患儿家庭成员，特别是密切接触者，易成为隐性感染者，易造成手足口病传播。手足口病病区医护人员是手足口病患儿的长期密切接触人员，是手足口病传播风险的人群，但病区医务人员粪便标本均未检出EV71和Cox A16，提示虽然手足口病病区医务人员长期接触手足口病患儿，但EV71和Cox A16隐性感染的可能性低，与医务人员既往感染体内已产生抗体或预防控制意识强有关，因此不容易感染EV71和Cox A16，作为隐性感染者传播意义不大。