作为世界卫生组织(WHO)于2002年倡导各成员国开展不同程度的食源性病原监测和疾病负担研究的能力建设项目的重要组成部分：上海市基于实验室非伤寒沙门菌的诊断和鉴定能力历经自主改良和中美两国疾病预防控制中心(CDC)的技术交流与合作，并逐步融合进国家重大专项建立的分子分型(脉冲场凝胶电泳，PFGE)网络化实验室和资源库^[1]。近期，耐药非伤寒沙门菌再次引发全球公共卫生机构关注^[2]。本次作者汇总分析自2005-2012年由公共卫生和临床实验室组建的感染性病原体网络化实验室开展针对人群和环境、食物链的沙门菌综合监测数据，重点研究旺兹沃思沙门菌的克隆进化和耐药分子流行病学特征，为国内相关领域研究提供科学参考。

2005年开始加强公共卫生实验室检测伤寒和非伤寒沙门菌能力。粪便肛拭子标本直接接种XLD平板(兼顾志贺菌分离)和SBG增菌液，置36 ℃培养16~22 h，增菌液划线接种XLD和CAS平板，置36 ℃培养18~24 h，挑选可疑典型菌落(XLD：中等大小、产硫化氢、半透明、扁平无色的湿润菌落；CAS：边缘光滑湿润的酒红色菌落)≤3个菌落分别接种肠道细菌综合发酵管和CAS菌落验证试验，36 ℃培养24 h后8个生化指标符合者，使用沙门菌OMA-OMD多价血清诊断血清群后初步报告(第4天)，最终血清型鉴定和抗生素敏感性试验分别按照相应标准作业程序(SOP)要求完成并报告(5~7天内完成)；2008年开始加强临床实验室检测非伤寒沙门菌能力。除CAS外，其他材料和方法同上，要求第4天报告血清群或者血清型，第5天常规报告耐药结果^[1]。基于SOP过程的方法解释分别申请并获得2项发明专利：生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒和筛选方法(专利号：ZL201010251650.5)；沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用(专利号：ZL201010550372.3)。

上海市网络实验室集成临床和环境食源标本检测流程，采用临床与公共卫生实验室执行的“上海市感染性食源性病原菌(沙门菌)监测网络实验室标准操作规程”，由各哨点实验室按照流程分段规范完成人源和非人源(环境源、食源、水源等)采样、样品前处理、初筛甄别、表型确认与血清分型、复核及系统生化反应检测，完成临床腹泻病例和环境、食品源沙门菌连续性监测^[1]。参比实验室统计上海市2005-2012年开展连续性沙门菌综合监测的优势血清型构成排序(包括人源和非人源、常见与非常见沙门菌株)；确认旺兹沃思沙门菌腹泻株及病例信息。凡菌株抗原式符合[39:b:1,2]者复核鉴定为旺兹沃思沙门菌。

2005-2012年上海市网络实验室连续性监测的人源和非人源沙门菌6358株，旺兹沃思沙门菌81株(人源30株、非人源51株)；测试抗生素敏感试验旺兹沃思沙门菌79株(人源29株、非人源50株)；大肠埃希菌ATCC25922为药敏试验质控菌株；布伦登卢普沙门菌H9812作为PFGE的分子质量标准菌株(由上海市CDC菌种保藏室提供)。

包括胰大豆胨蛋白胨肉汤(TSB)、亚硒酸煌绿增菌液(SBG)、罗伯特增菌液(RVS)、木糖赖氨酸胆酸盐琼脂平板(XLD)、沙门菌显色琼脂平板(CAS)、抗生素敏感性琼脂平板(MH)、沙门菌“O”和“H”相位鉴定琼脂平板、肠道双支糖综合鉴别管和其他生化鉴定管(上海科玛嘉微生物技术有限公司)、沙门菌分型血清145种(SSI，丹麦)、限制性内切酶XbaⅠ(TaKaRa，日本)；低熔点琼脂糖(SeaKem Gold，Cambraex Bio Rockland，美国)。以上试剂和血清等均避光置10 ℃以下保存，有效期内使用。采用VitekAM-60自动生化鉴定仪和菌液比浊仪(生物梅里埃，法国)；脉冲凝胶电泳仪(CHEF mapper system)和凝胶成像系统(GEL Doc2000，Bio-Rad，美国)。

利用药敏分配器和16种抗生素纸片[四环素(TET)、头孢替呋(EFT)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、氨苄西林(AMP)、复方新诺明(SXT)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(C)、氧氟沙星(OFX)、萘啶酸(NA)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、甲氧苄氨嘧啶(W)、头孢他啶(CAZ)、庆大霉素(CN)、磺胺异恶唑(S3)、链霉素(S)](Oxoid，英国)；参照CLSI-2012年颁布的纸片法判定标准M-100解释抗生素的敏感(S)、中介(I)、耐药(R)。EFT判断标准由厂家提供，分别为≤20 mm,21~22 mm,≥23 mm。多重耐药型MDR-ACSSuT：对AMP、C、S、S3、TET均耐药的多重耐药菌^[3]。

按照PulseNet China技术方案规定的非伤寒沙门菌PFGE-XbaⅠ标准方法，完成80株旺兹沃思沙门菌(人源29株、非人源51株)凝胶电泳并使用BioNumerics(Version 6.0)软件进行聚类分析。

自2006年确认上海市首例旺兹沃思沙门菌感染的腹泻病例至2012年，网络实验室共报告29例旺兹沃思沙门菌临床感染病例。除2012年(病例数为13例)外，其余的年度病例数在1~5例，属于低水平散发状态。29例感染的腹泻病例：男性病例(10例)明显少于女性(19例)；4岁以下和60岁以上的老人占半数以上；市区病例明显多于城郊；夏季病例明显多于春季和秋季；临床症状以腹泻、发热和腹痛为主，偶见血流感染病例。病例特征信息见表 1。

统计2005-2012年上海市网络实验室连续监测的人源沙门菌4553株，依据相同病例(菌株)数和血清群排列最常见的21个血清型依次为：B群的乙型副伤寒、斯坦利、胥戈成格隆、圣保罗、德比、阿贡纳、鼠伤寒；C1群的布伦登卢普、汤卜逊、婴儿、维尔肖、姆班达卡；C2~3群的纽波特；D群的肠炎；E1群的明斯特、鸭、火鸡、伦敦；E4群山夫登堡；F群的阿伯丁；Q群旺兹沃思。除Q群外其余20个血清型均属A~F群，代表区域内最常见的人源沙门菌血清型分布；旺兹沃思沙门菌在F群以外的少见人源沙门菌中排第1位(菌株数30、病例数29)，旺兹沃思在各年度的人源沙门菌血清型总排序变化和分布构成见表 2。

统计2005-2012年上海市网络实验室连续监测的非人源沙门菌1805株，依据相同的环境和食源性沙门菌株数和血清型排列最常见的血清型依次为：B群的乙型副伤寒、斯坦利、胥戈成格隆、圣保罗、德比、阿贡纳、鼠伤寒、印第安纳；C1群的罗森、汤卜逊、新加坡、坡、婴儿、姆班达卡；C2~3群的肯塔基；D群的肠炎；E1群的鸭、火鸡、伦敦、阿玛耶；E4群山夫登堡；F群的阿伯丁；I群非丁伏斯；M群波摩那、Q群旺兹沃思。除Q、M、I群外的21个血清型组成了最常见的非人源沙门菌血清型：相比人源中某些优势型(布伦登卢普、维尔肖、纽波特、明斯特)，印第安纳、罗森、新加坡、肯塔基、阿玛耶、非丁伏斯、旺兹沃思更具有食源沙门菌的血清型优势。旺兹沃思沙门菌在F群以外的少见非人源沙门菌中排第1位(菌株数50：养殖牛蛙13株、淡水鱼、虾、蟹、螺13株、养殖甲鱼7株、海水贝壳6株、江水和生活污水3株、猪肉制品3株、蔬菜2株、海水鱼类、酸奶制品和鸭粪各1株)，旺兹沃思在各年度的非人源沙门菌血清型总排序变化和分布构成见表 2。

使用16种抗菌药物纸片检测79株(人源29株、非人源50株)旺兹沃思沙门菌药物敏感性。29株人源株对绝大多数抗生素较敏感，耐药率最高的为S3(34.5%耐药和24.1%中度耐药)；氟喹诺酮类抗生素(CIP和NA)的耐药率为6.9%，但参照伤寒、副伤寒判断标准：CIP有31.0%的中度耐药；有1株对所有头孢类均耐药；有2株12重耐药MDR-ACSSuT。50株非人源菌株对所有头孢菌素均敏感，耐药率最高的是S3(44.0%耐药和20.0%中度耐药)。氟喹诺酮类抗生素虽仅对NA有6%的耐药，但参照伤寒、副伤寒判断标准：CIP有8.0%耐药和62.0%的中度耐药；非人源旺兹沃思沙门菌对TET、AMC、AMP、SXT、CIP、W、CN、S3的耐药率和人源株间差异无统计学意义(P>0.05)，见表 3。

80株(人源29株、非人源51株)旺兹沃思沙门菌经XbaⅠ酶切产生44种带型，优势带型依次为1型(6株)、2型(5株)、3~6型(各4株)、7~10型(各3株)、11~17型(各2株)、18~44型各1株。图谱经软件聚类后生成5个具有明显不同的独立克隆族，即克隆族A由6株1型、3株9型、2株13型和1株(33~37型)构成；克隆族B由5株2型、3株8型、2株(14、15型)和1株(27~32型)构成；克隆族C由4株(3、4型)、2株(16、17型)和1株(18、19型)构成；克隆族D由4株(5、6型)、3株7型、1株(20~26型)构成；克隆族E由3株10型、2株(11、12型)和1株(38~44型)构成。除克隆族E以外，其他族间菌株的同源相似性在90%以上。克隆族A的耐药特征显示明显和其他族不同，属MDR型克隆：3株9型、2株12型和1株(34~36型)合计8株：包括2012年长宁区中心医院的2株同型腹泻病例株(疑似暴发病例)为12重耐药的MDR-ACSSuT(TET、AMC、AMP、SXT、CIP、C、OFX、NA、W、CN、S3、S)；6株非人源株(3株甲鱼、2株牛蛙和1株牛肉)为6重耐药的MDR(TET、AMC、AMP、SXT、CIP、NA、W、CN、S3、S)。B克隆族中的优势型为2型和8型，两者高度同源且提示存在潜在暴发病例；2型中的1株2004年来自国际机场入境厕所污水的疑似腹泻菌株提示存在优势菌型的跨境输入。A~E克隆族的病例数和低年龄组病例数依次为3、8、7、5、6和1、0、6、0、1，提示B、D、E克隆族是引起成人感染性腹泻的克隆：B和E克隆族的非人源株来自淡水和海水养殖鱼介类产品、D克隆族的非人源株多来自养殖的牛蛙；而C克隆族是导致<5岁的低年龄组幼儿的感染(包括1例血流感染病例)，其非人源株主要来自淡水养殖鱼介类及个别猪肉和奶制品。统计和病例株具有100%遗传同源性的非人源菌株的分布：牛蛙5株、海水贝壳类4株、淡水鱼和贝壳类2株、甲鱼2株、蔬菜2株、机场国际到达通道的厕所污水1株，PFGE聚类见图 1。

图 1 旺兹沃思沙门菌PFGE聚类分析图谱(限制性内切酶：XbaⅠ) Fig. 1 Pulsed field gel electrophoresis patterns of S. Wandsworth strains (restriction enzyme:XbaⅠ)

图选项

旺兹沃思属G群沙门菌，国内既往除无症状感染者和蛇制品的分离报道外，并未见感染与暴发病例和环境分布特征的报道^{[4, 5, 6]}。也不可排除某些实验室因其非A~F群特性所致诊断和甄别困难继而漏检或漏报可能性。上海实验室(网络)能力建设从公共卫生和临床实验室整合与集成的角度设计常规化的分离流程，强化临床标本的病原识别和诊断能力^[2]。依据本次监测数据，旺兹沃思沙门菌是本地区罕见血清型中的最优势的血清型，其非人源株多来自养殖的淡水和海水产品，尤其是牛蛙和甲鱼等两栖类动物。病例高危人群为5岁以下幼儿和60岁以上老年人，结合流行病学调查(不洁饮食暴露病例>60%)和城市病例显著高于城郊的流行特征提示传播途径和食源性污染有关。其近年来病例数从过去低水平呈现较快上升的趋势值得重视。

旺兹沃思沙门菌于20世纪7080年代曾在香港有多重耐药菌的流行，并曾一度因直肠体温计的交叉污染引起医院儿科病房持续院感暴发^{[7, 8]}。2007年美国23个州报告69例食源性病例(除3例成人病例外其余为10月龄至3岁的学龄前儿童)确认为旺兹沃思和鼠伤寒混合感染的暴发病例，56例血流感染和6例住院的临床特征说明旺兹沃思对幼儿有较强致病性；调查证实商品化食品(膨化饼干)是导致持续隐性和分散病例的传染源^[9]。本次监测发现2012年的3例3型低年龄组病例(含1例血流感染)、2011年的4例成人病例(3例2型和1例8型)和2012年的2例9型MDR成人病例均属疑似院感和食源性暴发的同源性克隆(图 1)。虽然国内沙门菌引发的院感暴发较以往少见，但旺兹沃思同源感染(包括MDR病例)增多现象值得公共卫生部门加强对不同人群，尤其是低年龄组人群的腹泻病综合监测。

2013年美国CDC发布了“国家抗生素耐药报告”明确将耐药的伤寒和非伤寒沙门菌定义为严重威胁。分子耐药机制研究证实高耐药鼠伤寒动物源菌株和人源菌株之间的克隆转化暂时存在种群障碍^[10]。国内于2004年也建立了非伤寒沙门菌分子分型网络数据库，监控和研究典型的多重耐药沙门菌暴发疫情。我们将耐药与分子分型结合发现：不论是导致成人感染的克隆族B、D、E、还是导致低年龄组感染的克隆族C均为敏感株，来源除境外输入可能外，多以淡水或海水养殖鱼介类(包括甲鱼和牛蛙)为主。虽然A克隆族的9型MDR疑似暴发病例，且和甲鱼、牛蛙高度同源性，但亦无证据认为MDR株即具高致病或流行的能力。不过，各类养殖产品可能通过接触环境中抗生素诱导寄生菌产生高耐药菌株导致的潜在食源性危害不容忽视，有必要通过国家网络实验室加强对高耐药旺兹沃思沙门菌的预警和防控^[11]。

我们注意到泰国蛇园中的养殖者和蛇之间的确存在旺兹沃思沙门菌的生态循环的报道^[12]。结合香港的院感案例和本次环境食物链监测数据初步判断：蛇、甲鱼、牛蛙可能旺兹沃思的自然宿主，东南亚地区相对高发的流行特征和该地区的特殊消费行为有关；国内的养殖牛蛙和甲鱼可能成为该菌富集和诱导耐药克隆的宿主；此外，上海作为国内经济发达地区——其人群的消费和行为模式越来越接近发达国家，尤其是近年持续升温的境外(东南亚)旅游也可能是间接致旺兹沃思病例数增加的重要原因^[13]。

综上所述，我们建议国家有关机构在重视发展养殖食用两栖类爬行动物(牛蛙和甲鱼)和其他特种淡、海水鱼介类产品所带来巨大经济效益的同时，不因忽略日益严重的生态环境污染所致沙门菌宿主寄生而持续引发的食源性暴露风险。因为，当快速城市化进程打破传统的人与自然界生态物种间的安全距离和平衡时，其结果会导致高危人群感染不常见病原菌，即行为生态型传染病^[14]。