人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种无囊膜的双链DNA病毒，流行病学与分子生物学研究表明HPV能引起人体黏膜和皮肤上皮细胞病变，并且HPV持续感染是女性宫颈病变的主要原因^[1]。国际肿瘤研究所根据其致癌性与否将HPV亚型分为高危型和低危型两类。高危型HPV是宫颈癌的主要发病因素，而低危型HPV引起良性病变较多^[2]，99%的宫颈癌患者检测出HPV高危亚型感染^[3]。在1~2年内多数感染者HPV会清除也不会有明显病变发生，但还是有部分会存在持续感染^[4]。同一亚型HPV的持续感染会大大增加宫颈癌发生的风险^[5]。有效的医学干预能够降低宫颈癌的发病率，及早发现HPV感染分型对提前进行防治有重要的临床意义。研究表明HPV亚型分布与地区、环境、人群等因素相关^[6]，为了解浙江省湖州地区HPV基因分型及流行分布情况，本研究采用基因芯片技术对浙江省湖州市中心医院就诊的10 680名妇女的宫颈脱落细胞标本进行基因分型检测，现报道如下。

收集2011-2013年浙江省湖州市中心医院就诊女性宫颈脱落细胞11 676份，剔除复诊病例996例，获得有效宫颈脱落细胞标本为10 680例，年龄为15~85岁，平均年龄(39.79±10.15)岁。

PCR扩增仪MyCycler^TM Thermal Cycler购自美国BIO-RAD公司；分子杂交炉(Hybaidshake'n'stack)购自美国Thermo Electron公司。离心机为德国Hettich公司，Mikro200型号。人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒和人乳头瘤病毒分型基因芯片阅读仪Decipher^TMHPV1000为亚能生物技术(深圳)有限公司产品。该试剂医疗器械注册证书编号为：国食药监械(准)字2014第3401227号，有文献报道其敏感度、特异度分别为96.36%和95.36%^[7]，能够满足实验检测需要。

用试剂盒配套专用脱落细胞采集器进行采样，将宫颈刷于宫颈口单方向旋转4~5周以获得足量的上皮细胞样本，将样本放人专用细胞保存液中，折断宫颈刷柄，旋紧管盖，做好样本标识，-20 ℃保存待检。

快速溶解采集器内洗脱液，充分漂洗宫颈刷后，取1 ml洗脱液移到1.5 ml微量离心管中，13 000 r/min离心10 min，弃去上清，保留管底的细胞沉淀。加入50 μl裂解液悬浮沉淀，100 ℃水浴加热10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清液备用。

(1) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 扩增：取PCR反应管做好标记，加入已提取的待测样品DNA 5 μl，反应总体系为25 μl，低速离心数秒。按以下条件扩增：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；然后以94 ℃ 10 s；42 ℃ 90 s；72 ℃ 30 s，10个循环；94 ℃ 10 s；46 ℃ 60 s；72 ℃ 20 s，30个循环；72 ℃ 延伸5 min。(2)杂交：取15 ml离心管，放入标有患者编号的膜条，加入A液 5 ml及所有PCR产物，按HPV基因分型检测试剂盒说明进行杂交显色，显色结果亦按说明书进行判定。膜条上探针按固定顺序排列，由蓝色斑点显现位置即可断定HPV的亚型。其中，高危型包括：HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68；低危型包括：HPV6，11。PC为显色质控点。

数据采用SPSS 19.0统计学软件处理，计数资料比较采用χ²检验。

2011- 2013年，浙江省湖州市中心医院妇科年初诊数分别为3135、5450和7003例。初诊患者年HPV检测构成比逐年上升，分别为1504/3135(47.97%)、3433/5450(62.99%)和5743/7003(82.01%)，感染率逐年降低分别为597/1504(39.69%)、1002/3433(29.19%)和1266/5743(22.04%)。2011-2013年生殖器疣、宫颈上皮异位和宫颈癌的HPV开展情况见表1。

10 680名女性中有2865名感染HPV，总阳性率为26.83%。检出最高的型别是HPV16型，检出构成比为17.52%(718/4099)，也是单一阳性率及多重阳性率最高的亚型，分别为19.62%和15.53%，见表2。HPV各亚型在2865份阳性样本中HPV16、HPV52和HPV58感染率明显高于其他亚型，分别为25.06%、21.92%和17.77%。

10 680例送检者年龄为15~85岁，以25~49岁最多，共8485例，占79.16%。在所有年龄组中<20岁年龄组阳性率最高，达63.10%；其次是20~24岁年龄组，阳性率为32.48%； 30~岁年龄组感染率相对较低。<20岁年龄组HPV感染率与其他各年龄组差异均有统计学意义(与20~岁组比较：χ²=30.27，P<0.01；与其他各组比较：χ²=34.56~64.70，P<0.01)。20~24岁组还与30~岁四组差异有统计学意义(与30~34岁组比较：χ²=6.28，P=0.012<0.05；与35~49岁三组比较：χ²=13.64~17.92，P<0.01)，与其他组别比较P>0.05，差异无统计学意义。20岁以下组高危型、低危型、高低危混合型感染率均明显高于其他年龄组，分别为34.52%、10.71%和17.86%。其他感染率相对较高的有：高危型感染中≥55岁组26.80%；低危型感染中25~岁组4.76%；高低危混合型中20~岁年龄组7.49%，见表3。

HPV感染存在多种亚型同时感染的情况，不同年龄组HPV单一感染和多重感染检出情况见表4，单一感染1993例，占69.56%(1993/2865)； 二重感染为两种亚型阳性，占22.13%(634/2865)，三重感染占5.34%(153/2865)，四重感染占2.20%(63/754)，五重及以上感染占0.77%(22/2865)。单一型感染中45~49岁组感染率最高为77.56%(318/410)，45~49岁年龄组单一型感染率与<34岁及≥50岁6组差异有统计学意义(与<30岁的三组比较：χ²=7.73~34.45，P<0.01；与30~34组比较：χ²=5.56，P<0.05)。与35~44岁组比较χ²=1.535和1.965，P>0.05，差异无统计学意义。二重感染中<20岁组感染率最高为43.40%(23/53)，<20岁组二重感染率与其他年龄组差异均有统计学意义(与20~24岁组比较：χ²=4.748，P<0.05；与其他7组比较：χ²=7.348~40.485，P<0.01)，见表4。

宫颈癌、生殖器疣和宫颈柱状上皮异位为与HPV感染密切相关的妇科疾病。HPV阳性率最高为生殖器疣76.57%，与宫颈癌组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与宫颈柱状上皮异位组比较差异有统计学意义(χ²=62.730，P<0.01)。阳性中高危型最高为宫颈癌患者达96.88%，与生殖器疣组及宫颈柱状上皮异位组比较差异均有统计学意义(χ²=22.470和68.919，P<0.01)。分析湖州地区最常见的16，52，58型HPV感染，在高危型感染中宫颈癌患者3种亚型比例最高，为74.19%，分别与生殖器疣组比较差异有统计学意义(χ²=4.167，P>0.05)，与宫颈柱状上皮异位组比较，差异无统计学意义(χ²=1.129，P<0.05)。HPV高危型多重亚型感染比例为宫颈癌组最大，为25.81%，与生殖器疣组和宫颈柱状上皮异位组比较差异无统计学意义(χ²=0.768和0.628，P>0.05)。

本研究应用基因芯片技术对湖州地区女性的HPV感染情况进行了大规模样本的调查，实验结果显示2011- 2013年全年检测人数、初诊HPV检测率及阳性人数持续增加，而感染率逐年降低。分析原因可能是患者及医生对HPV检测及防御意识增加。10 680份样本中HPV感染者2865例，感染率为26.83%，与浙南地区(29.5%)^[8]、杭州拱墅区(25.9%)^[9]、上海地区(28.5%)^[10]接近，低于重庆地区(37.3%)^[11]、辽宁省(45.6%)^[12]，高于青海省(16.72%)^[13]和云南地区(21.53%)^[14]，不同区域HPV感染率差异有统计学意义。感染率呈现北方中部地区>东南沿海地区>偏远西南地区。本研究中，高危亚型(8.90%)、单一感染(69.56%)为本地区主要类型。HPV单一感染中以HPV16 最常见，占单一型感染的19.62%(391/1993)，其次为HPV52和58，分为364和219例，三者合计占单一型感染者的34.00%(974/2865)。多重型感染中最常见的3种亚型为HPV16，52，58型合并感染，合计感染的构成比为45.25%(1855/4099)，所占比例接近半数。数据表明湖州地区宫颈癌与HPV高危亚型密切相关，而16，52，58三种亚型均为高危亚型，在宫颈癌中这三种高危亚型比例明显高于生殖器疣组，但与宫颈柱状上皮异位组差异无统计学意义。因此湖州地区HPV筛查可以高危型为重点，尤其是16，52，58型，对宫颈癌的筛查有重要临床意义。此结果与我国其他地区报道一致^[15]，也符合亚洲人群研究结果，提示HPV感染除阳性率在地区间有较大差异，亚型的分布在各地区较为一致。但与国外人群有差异，美国感染率前3位基因型为HPV16，53，52^[16]，芬兰为HPV16，31，52^[17]。

HPV不同年龄组亚型分布各有其特点。本研究显示10 680名受检女性在<20、20~、25~、30~、35~、40~、45~、50~、≥55岁年龄组中感染率呈现2个峰值，两端高中间低，说明年龄<34岁和≥50岁人群HPV感染率较大。尤其是<20岁人群，感染率高达63.10%，明显高于其他组；并且多数为多重感染，二重三重四重感染率均排列第1位。此类感染人群感染率高，原因可能与检测标本数量少，多数就诊患者已有相应症状有关，而且该年龄组处于性活跃期，宫颈环境未成熟也可能是原因之一。35~49岁人群虽然检测人数及感染人数最多，但感染率并不高且感染率较稳定，多为单一型感染。≥50岁人群感染率增高，并且≥55岁年龄组，五重及感染人数最多。原因可能是处于绝经期宫颈环境及机体内分泌不稳定，免疫力下降感染风险相对增加。有文献^[18]报道<30岁女性的HPV多为急性感染，清除率高，应重视51岁以上患者的高危型HPV感染。不同年龄HPV的感染率差异有统计学意义，这一差异主要与就诊者自身免疫、生活环境及卫生习惯等因素有关，同时健康的性生活对HPV的预防也有重要意义。

研究显示，宫颈癌及生殖器疣患者HPV阳性率明显高于宫颈柱状上皮异位患者，低危型感染病症之一为生殖器疣，高危型感染率宫颈癌患者明显高于其他人群，与有关文献报道一致^[19]。而本研究中湖州地区常见型感染及多重高危型感染并不能直接证明其与宫颈癌病变相关。考虑可能与标本类型，取样及数量或检测差异有关。

持续HPV高危型感染是宫颈癌发生的必要条件，HPV检查是目前预防及控制宫颈癌发生的主要手段。HPV亚型筛查可以及时发现高危型感染人群，使其能够早诊断、早治疗，做到早期阻断宫颈癌病变的进一步发展，有效降低宫颈癌的发病率和死亡率。希望医院及各类卫生机构重视女性HPV亚型的普查工作，定期对已婚妇女进行HPV亚型检测。本实验首次对本地区女性进行大样本回顾性分析HPV感染和基因型分型状况，对本地的宫颈癌的防控提供了一定的理论依据。