霍乱弧菌是一种革兰阴性细菌，根据O抗原的不同分为210多个血清群，O1和O139群产毒株是引起霍乱流行的主要血清型菌株^[1]。1993年5月，我国新疆局部地区首次出现O139群霍乱弧菌暴发性流行，随后内地一些地区以及东南沿海地区出现流行或散发，而且从一些水体和食品中也分离到O139群菌株^[2]。1962年O1群埃尔托型霍乱弧菌传入上海，霍乱开始流行。随着霍乱弧菌的流行蔓延，上海市共经历3次流行高峰，主要出现在20世纪60年代、70年代末至80年代以及90年代。1994年在上海市发现了首例O139群霍乱病例，之后发生多起散发O139群霍乱疫情。自1994年后上海市出现多菌群(型)混合流行的局面。2005年后O139群霍乱弧菌为该市优势菌群，O1群霍乱弧菌以引起散发腹泻病例为主。

本研究对2005 -2014年上海市分离的O139群霍乱弧菌菌株进行分子特征和耐药性研究，包括毒力及相关基因检测、脉冲场凝脉电泳 (pulsed field gelelectrophoresis，PFGE)、多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和药物敏感试验，为上海市霍乱防控提供技术依据。

收集上海市自2005-2014年霍乱疫情及外环境(水体)和食品(水产)监测中分离的O139群霍乱弧菌86株。所有菌株经分离纯化后储存于甘油肉汤中于-80 ℃保存，其中分离自患者的菌株共44株，占51.2%；水产36株，占41.9%；水体6株，占6.9%，见表1。PFGE分型标准菌株为沙门菌H9812，药敏实验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，为本实验室自行保存。

双洗平板购自上海市疾病预防控制中心(CDC)培养基供应中心；革兰阴性鉴定板条购自法国生物梅里埃公司；霍乱弧菌诊断血清购自中国药品生物制品检定所；药敏纸片、MH琼脂购自英国Oxiod公司；限制性内切酶XbaⅠ、NotⅠ、100 bp DNA Ladder Marker、Taq Premix、琼脂糖购自宝生物工程(大连)有限公司；Seakem Gold低熔点琼脂糖购自美国Cambrex Bio Science Rockland公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAmp DNA Mini Kit)购自Qiagen公司。引物序列由上海生工生物工程有限公司完成。

PCR基因扩增仪(Bio-Rad DNA Engine Dyad)、脉冲场凝胶电泳仪(Bio-Rad CHEF Mapper)、凝胶成像系统(Bio-Rad GEL Doc2000)。

甘油肉汤中于-80 ℃保存的菌株，接种于双洗平板进行分离培养。所有菌株按照WS 289-2008《霍乱诊断标准》方法进行生化和血清学鉴定。

菌株37 ℃培养过夜，使用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，-20 ℃保存。对86株霍乱弧菌进行6种毒力及相关基因分析，包括霍乱毒素基因(ctxA)、溶血素基因(hlyA)、毒素协调菌毛基因(tcpA)、调控蛋白基因(toxR)以及编码霍乱毒素基因的CTXφ基因组基因(zot、ace)，根据参考文献合成引物序列^{[3, 4, 5]}。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃，4 min。扩增产物用0.5×TBE配制的1%含Goldview染液的琼脂糖凝胶中电泳，以100 bp DNA Ladder Marker为参照，于凝胶成像系统中观察结果。

按照PulseNet监测网络中霍乱弧菌PFGE标准分型方法(NotⅠ 酶切)^[6]。PFGE图像应用BioNumerics软件(Version 6.0，Applied Maths)处理，聚类方法采用非加权组平均法(UPGMA)。

按照http://pubmlst.org/vcholera/标准操作。引物序列合成参考标准操作。扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃，4 min。扩增产物送至上海伯臻生物科技有限公司进行双向测序。将测序拼接产物在http://pubmlst.org/vcholerae/分别进行7种管家基因比对，并比较获得相应ST型别。

采用世界卫生组织(WHO)推荐的改良K-B纸片法。抗菌药物包括头孢曲松、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、丁胺卡那霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、氨苄西林、庆大霉素。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922为上海市CDC中心实验室提供，结果判断按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准。

对86株霍乱弧菌进行毒力基因分析，结果显示共有62株产毒株，24株非产毒株。其中患者来源O139群霍乱弧菌菌株93.2%(41/44)为产毒株，水产来源菌株58.3%(21/36)为产毒株，6株水体来源菌株均为非产毒株。产毒株的6种毒力基因及相关基因均为阳性，非产毒株仅hlyA毒力基因和toxR调控基因阳性。

共分为35个型别，见图1。其中44株患者来源菌株共分为21个型别，36株水产来源菌株共分为16个型别，水体来源菌株为6个不同的型别。有6个带型的菌株分别来自水产和患者，KZGN11.SH0019带型菌株分别来自水产和水体，KZGN11.SH0033带型菌株分别来自患者和水体。不同的年份有部分菌株有相同的PFGE带型。

图 1 O139群霍乱弧菌PFGE分型 Fig.1 PFGE types of V. cholerae O139 strains

图选项

共分为9个ST型。 其中患者来源的41株O139群霍乱弧菌产毒株和水产来源的21株产毒株的ST型一致，均为ST 69型。此ST型别和1992年印度流行的O139群菌株MO45及第7次大流行的孟加拉国大流行株N16961 ST型别一致^{[7, 8]}。1株患者来源非产毒株、7株水产来源非产毒株和2株水体来源非产毒株ST型一致，均为ST 162型，见表2。其余非产毒株均为不同的其他ST型别，型别较为分散。

86株O139群霍乱弧菌经11种抗菌药物敏感性试验检测，结果显示产毒株的耐药情况比非产毒株严重。O139群霍乱弧菌产毒株对强力霉素、复方新诺明、四环素、萘啶酸、氨苄西林、庆大霉素的耐药率为51.6%～90.3%不等。非产毒株对萘啶酸的耐药严重，为95.8%，其余10种药物的敏感率为83.3%～100%不等，见表3。患者来源3株O139群霍乱弧菌非产毒株对复方新诺明和萘啶酸为100%耐药。

本研究将2005-2014年上海市霍乱疫情及外环境(水体)和食品(水产)监测中分离的O139群霍乱弧菌菌株进行整理和分析。对86株O139群霍乱弧菌进行毒力及相关基因特征分析、PFGE分型、MLST分型和药物敏感试验。研究发现引起霍乱病例的O139群霍乱弧菌主要为产毒株，但患者来源菌株中仍有6.8%的菌株为非产毒株，提示O139群霍乱弧菌非产毒株仍可致病，表明霍乱弧菌可能存在霍乱毒素以外的致病机制。本研究的患者来源非产毒株中的1株菌株同时产生褐色色素，王瑞白等^[9]研究发现产色素的非产毒O139群霍乱弧菌在环境中有更强的生存能力。此类O139群霍乱弧菌可能通过溶原性噬菌体CTXφ 介导的霍乱毒素基因水平转移，在这类菌株获得毒素基因后，有可能基于其更强的环境适应能力而成为新的流行克隆群，在霍乱弧菌的环境监测中需提高对这类菌株的关注。

PFGE是基于细菌全基因组的分子分型方法，在霍乱分型的应用中显示了更强的分辨力和流行病学调查能力^{[10, 11, 12]}。本研究利用PFGE分型方法对上海市的O139群霍乱弧菌进行分型，显示患者来源菌株和水产来源菌株带型一致，遗传相关性较近，来自同一克隆系，同时上海市的多起霍乱疫情流行病学调查显示均为食源性感染^{[13, 14]}，提示该市多起霍乱疫情的传染源是被O139群霍乱弧菌污染的水产，提示在霍乱防治工作中应持续加强对水产品的监测，并及时进行O139群霍乱弧菌的PFGE分型监测。研究中发现不同年份霍乱疫情中的菌株有相同的PFGE带型，提示有相同基因特征的菌株持续存在引起新的病例^[15]，对此类分子型别的菌株应引起注意，防止引起霍乱暴发流行的发生。

MLST分型显示近10年来O139群霍乱弧菌和早期在印度流行的O139群霍乱弧菌基因组成相似^[8]，证实了O139群霍乱弧菌管家基因随着时间的迁移存在一定的稳定性。研究也发现O139群霍乱弧菌产毒株和O1群霍乱弧菌产毒株的MLST型别高度一致，提示O139群霍乱弧菌产毒株可能起源于EVC产毒株。由于霍乱弧菌产毒株存在高度克隆化，产毒株之间的基因差异不大，因此MLST分型方法不适用于对霍乱弧菌产毒株的分子分型研究。

随着抗生素的滥用，细菌耐药现象日益严重。同样水产养殖业利用抗生素防止水产养殖病害的发生，导致水产品细菌的耐药严重^[16]。连续10年的药物敏感试验显示O139群霍乱弧菌对强力霉素、复方新诺明、四环素、萘啶酸保持着较高的耐药率，并对诺氟沙星和环丙沙星开始出现耐药，头孢曲松和丁胺卡那霉素对O139 群霍乱弧菌保持较高的敏感性。本研究的耐药监测结果与Yu等^[17]对全国的O139群霍乱弧菌的耐药结果一致，研究中发现患者来源O139群霍乱弧菌非产毒株和患者来源O139群霍乱弧菌产毒株相比仅对复方新诺明和萘啶酸高度耐药，显示上海市O139群霍乱弧菌产毒株耐药严重，并存在多重耐药问题，提示在霍乱防治工作中，应进一步加强对O139群霍乱弧菌的耐药监测，掌握O139群霍乱弧菌的耐药谱变化。