原核生物在正常的生存过程中不断面临外源性基因的侵扰，为了保持自身基因的稳定性和完整性，进化出了多种机制用于对抗外来基因的入侵。规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与相关蛋白组成的CRISPR/Cas系统就是其中重要之一^[1]。90%的古细菌和40%以上的真细菌均存在此结构，实现细菌的部分免疫功能。CRISPR结构中的间隔序列(Spacer sequences)，来源于外来入侵的基因片段^[2]，记录了原核生物被外源性基因入侵的历史^[3]。随着测序技术的进步，完成全基因组测序工作的菌株越来越多，为更准确的发现和预测CRISPR/Cas系统提供了更便利的条件。同时，作为细菌重要的外源基因入侵载体的噬菌体基因组测序数量也大量增加。本研究利用已经完成全基因测序的菌株序列预测出的CRISPR结构，找到其中的间隔序列，分析间隔序列在基因组中的分布情况，并与已经公布的噬菌体基因组进行同源性比较，发现其中可能存在的规律。

本研究的CRISPR数据来自于CRISPRs database数据库(http://crispr.u-psud.fr/crispr/)。此数据库是对已有的细菌全基因组数据利用CRISPR finder软件预测分析存在的CRISPR/Cas系统的结构^[4]。

噬菌体序列来自于GenBank数据库上公布的噬菌体序列(www.ncbi.nlm.gov)，共有1444条噬菌体基因组序列。

使用从GenBank上下载的1444条噬菌体序列数据建立数据库，以CRISPRs database数据库中的全部间隔序列数据与噬菌体序列数据库进行比对，使用BLASTN 2.2.27软件，按照参数默认设置进行。对完成的比对结果进行后续分析。

确定比对成功的条件：(1)根据序列比对方法的经验，选择完全比对上的结果。参数设置为Identity值为1，Gap值为0，E-value(E值)为<0.02。按照一般比对要求，E-value<0.01即可以认定为序列比对结果有效。(2)在分析CRISPRs database数据库中间隔序列时发现，存在小部分序列长度小于20 bp，多为14~18 bp。此部分序列由于过短且造成随机匹配的概率大大增加，影响整体结果，依据经验也将此部分序列排除在比对数据之外^[5]。

截至2014年8月CRISPRs database数据库共利用全基因组测序2762株菌株分析出4065个确定的CRISPR结构，其中150株古细菌基因组中的126株和2612株真细菌的基因组中1176株含有确定的CRISPR结构；其他还包括质粒基因组和不确定的CRISPR结构基因组，共计1940个。

分析以上所有CRISPR结构，共提取出90 096条间隔序列。观察CRISPR数据库整体数据情况，不同种属的细菌携带间隔序列数量分布呈现偏态，最多的含有832条，为嗜盐黏细菌(Haliangium ochraceum)DSM 14365；最少的仅有1条(共有331株菌)。多数细菌具有1~50条间隔序列(1414/1940，72.9%)，间隔序列数量>250条的仅有58株(58/1940，1.9%)。其中古细菌13株(13/150，8.6%)，真细菌45株(45/2612，1.7%)，差异有统计学意义(χ²=29.98，P<0.01)，见表 1。

将细菌基因组上的90 096条CRISPR间隔序列与1444条噬菌体序列进行比对后，共有来自于57种细菌的245株菌株的1055条间隔序列(1055/90 096，0.12%)，成功比对上363条噬菌体序列(363/1444，25.1%)。这245株菌中，古细菌49株(20%)，细菌196株(其中革兰阳性菌78株，占31.8%，革兰阴性菌118株，占48.2%)。其中按照菌种属分类排在比对成功数量前5位的是链球菌属34株(13.9%)，单增李斯特菌23株(9.4%)，沙门菌16株(6.5%)，大肠埃希菌14株(5.7%)，铜绿假单胞菌11株(4.5%)，分别来自于6~28个噬菌体序列，见表 2。

CRISPR/Cas系统被认为是原核生物的获得性免疫功能结构，广泛存在于原核生物中，抵抗外源性基因侵入。CRISPR/Cas系统基本的结构由多条保守的重复序列(Repeats)和插入其中的间隔序列构成，并在第一条重复序列前存在一条200~500 bp的前导序列，结合Cas蛋白基因，共同构成最基础的CRISPR/Cas系统^[6]。CRISPR/Cas系统至少通过适应(adaptation)和干扰(interference)两个阶段完成细菌抵抗外源性基因的入侵^[7]。在适应阶段，外源性的DNA一部分基因序列被CRISPR/Cas系统获得，并在前导序列和第一个重复序列插入，形成新的间隔序列。在干扰阶段，CRISPR位点进行转录(transcription)，全长的RNA序列被剪切成短CRISPR RNAs (crRNAs)，crRNAs与cas蛋白结合成复合体，利用插入的间隔序列以互补原理锚定在外源性基因，并使得外源性基因被降解^[8]。已经有多项研究表明，CRISPR/Cas系统可以阻碍细菌噬菌体的感染和质粒转化^[9,10]。

间隔序列在古细菌和真细菌基因组上存在差异。古细菌含有更多的间隔序列数量，可能原因为古细菌的生存和进化历史更为长久^[11]，长期被外源性遗传物质入侵积^[12]，积累更多的间隔序列。而真细菌多与人类或其他生物共存，生存环境较为复杂，基因的横向转移可以给细菌带来更多生存优势，所以在进化中间隔序列数量保持在一定范围内。

在以往的研究中，能够找到外援性基因来源的数量非常少。有研究表明仅有2%的间隔序列可以找到外源性基因来源：从67株菌株提取的4500条间隔序列中的88条可以比对上噬菌体、质粒和其他基因组序列，仅有47条间隔比对上噬菌体，成功比例仅为0.1%^[5]。通过本研究分析，我们从2762株菌中提取了90 096条间隔序列，里面仅有1055条间隔序列能够较为明确地从噬菌体找到来源，比例仅为0.12%，与有关报道相近^[13]。可能原因：(1)现有的对噬菌体的发现过少，虽然经过多年的研究和发现，基因测序技术不断发展，全基因组序列不断积累，序列数量不断扩大。但与自然界实际的存在情况相比，仍存在巨大的差距。研究最为广泛的大肠埃希菌，其间隔序列与噬菌体的比对成功率为5.1%(大肠埃希菌58株含有CRISPR结构，共有1030条间隔序列，比对成功的有14株的53条间隔序列)，远高于结果数据的平均值(差异有统计学意义，χ²=125.1，P<0.01)，说明进一步加大基础数据的积累，能够更有效的发现。(2)间隔序列长度较短，多为21~72 bp。为了保证比对的准确度，本研究提高了比对成功的标准，选择进一步降低E值，限定GAP为0，减少形成随机比对的误差。提高了比对条件，也在一定程度上降低了比对成功数量。(3)同时，由于间隔序列数据来源于已有全基因组测序的菌株，并且对CRISPR结构的识别更为严格，所以也可能丢弃了部分可能存在的间隔序列。(4)作为已完成测序的噬菌体和细菌全基因组数据，本身存在一定的偏倚。测序数据并不能完全代表自然界中细菌的分布情况，被大量测序的菌株和噬菌体多与人类疾病或工业生产相关，并且菌株存在一定的特殊意义才会进行测序并获取数据。

现阶段由于细菌全基因组测序数量的增加，发现的CRISPR系统数量也较以前大幅度提高。间隔序列与噬菌体序列的比对成功数量较以往研究已大大增加，但是整体成功率仍然较低(0.12%)，说明CRISPR系统中噬菌体来源的间隔序列所占比例可能较小，与细菌和噬菌体基因组发现较少相关，进一步深入研究可以大幅度提高成功率。